1、背景：抗蛇毒抗體根據(jù)來(lái)源可分為抗蛇毒血清（AV）及抗蛇毒雞卵黃抗體（IgY）兩種，前者從哺乳動(dòng)物的血液中分離而得，后者系從禽類(lèi)的卵黃中提取。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)外學(xué)者已從雞卵黃中制備出了抗cobra、Russell's viper、Saw-scaled viper，B．a(chǎn)rietans，B．nasicornis，B．rhinoceros，N．melanoleuca和N．mossambica等數(shù)種IgY，并能有效中和相應(yīng)蛇毒。在國(guó)內(nèi)

2、，抗眼鏡王蛇、抗蝮蛇、抗眼鏡蛇和抗蝰蛇毒Igy的制備及其特性研究亦有報(bào)道。與從其他哺乳動(dòng)物（如鼠、兔、豬、馬、牛等）血液中獲得抗體相比，卵黃抗體具有無(wú)法比擬的優(yōu)越性（Schade et al．1992；Larsson et al．，1991）：不與蛋白G或蛋白A結(jié)合，不會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，不與類(lèi)風(fēng)濕因子結(jié)合，避免了免疫檢測(cè)中的假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題；雞蛋來(lái)源方便，生產(chǎn)成本低，適于大規(guī)模生產(chǎn)；由免疫母雞所生的雞蛋黃中只有一種抗體，均一性好，理化性

3、質(zhì)穩(wěn)定，耐酸，耐熱，易于保存，運(yùn)輸和使用均很方便。另外雞與哺乳動(dòng)物種系關(guān)系遠(yuǎn)，少量刺激時(shí)即容易產(chǎn)生強(qiáng)免疫反應(yīng)。研制一種針對(duì)華南地區(qū)多種劇毒蛇的通用蛇傷防、治特效制劑－多價(jià)ASV，可在無(wú)需明確蛇傷的毒蛇種類(lèi)情況下立即使用，以贏得有效的最佳治療時(shí)機(jī)，對(duì)避免嚴(yán)重病變的發(fā)生和降低死亡率有著重要作用。在本實(shí)驗(yàn)室先前制備有單價(jià)抗眼鏡蛇及抗蝰蛇毒IgY，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研制雙價(jià)抗蛇毒雞卵黃抗體，為蛇傷救助提供新的途徑。 目的：通過(guò)制備雙價(jià)抗眼鏡

4、蛇、蝰蛇毒雞卵黃抗體，檢測(cè)其生物活性，并觀察其以口服制劑的形式對(duì)眼鏡蛇、蝰蛇傷小鼠的保護(hù)作用，為蛇傷的預(yù)防和治療提供一種新的方法，為替代馬源性抗蛇毒血清奠定基礎(chǔ)。 方法： 一、雙價(jià)抗蛇毒IgY的制備與提取 1、雙價(jià)抗蛇毒IgY的制備制訂合適的免疫方案，利用本所專(zhuān)利——蛇毒取毒器制備抗原眼鏡蛇、蝰蛇毒，分別與福氏佐劑按1：1（V/V）置自制的乳化器充分乳化，初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳

5、化蛇毒。每種抗原在初次免疫后的第三周、第五周各進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，免疫劑量間歇、逐漸加量。兩種單一抗原按順序依次交替注入單只雞體內(nèi)（雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射），注入間隔周期為一周。 2、雙價(jià)抗蛇毒IgY的檢測(cè)雙向免疫擴(kuò)散和免疫電泳鑒定卵黃中的特異性抗體；SDS-PAGE測(cè)定抗體產(chǎn)物的純度；以間接ELISA法檢測(cè)特異性IgY抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化以及IgY在血漿內(nèi)的效價(jià)變化。 3、雙價(jià)抗蛇毒IgY的提取采用本實(shí)驗(yàn)

6、過(guò)程中發(fā)明的卵黃分離收集器從卵清中分離出卵黃，用水稀釋法提取IgY抗體。 二、雙價(jià)抗蛇毒IgY的生物特性研究 1、利用雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定抗蛇毒IgY與中國(guó)常見(jiàn)10種蛇毒的交叉免疫反應(yīng)及其反應(yīng)強(qiáng)度。 2、眼鏡蛇、蝰蛇毒對(duì)卵黃膜均有不同程度的溶膜作用，用自制的卵黃膜溶膜檢測(cè)儀觀察雙價(jià)抗蛇毒IgY對(duì)蛇毒溶膜活性的中和作用。 3、雙價(jià)抗蛇毒IgY分別與眼鏡蛇、蝰蛇毒在體外中和，腹腔注射小鼠，觀察雙價(jià)抗蛇毒IgY對(duì)

7、蛇毒致死活性的中和作用。 三、雙價(jià)抗蛇毒IgY的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1、雙價(jià)抗蛇毒IgY按高、中、低三個(gè)濃度灌胃小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)殺鼠取血分離血漿，用間接ELISA法檢測(cè)灌胃小鼠血漿中雙價(jià)抗蛇毒IgY的效價(jià)。 2、雙價(jià)抗蛇毒IgY按高、中、低三個(gè)濃度灌胃小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)分別為小鼠腹腔注射眼鏡蛇、蝰蛇毒，檢測(cè)口服制劑雙價(jià)抗蛇毒IgY對(duì)小鼠的保護(hù)作用。 四、統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)，SPSS軟件等統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

8、 結(jié)果： 1、利用蛇毒取毒器制備的蛇毒活性高，含雜質(zhì)量少。用眼鏡蛇、蝰蛇毒粗毒、初次小劑量免疫后，卵黃中第9天即可檢測(cè)到特異性卵黃抗體。經(jīng)間歇、逐漸加量加強(qiáng)免疫，抗體效價(jià)持續(xù)增高，達(dá)到較高水平后，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)一直維持高效價(jià)。 2、在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中制備了卵黃分離收集器，利用此儀器收集試驗(yàn)用卵黃，卵清、卵黃分離度高，卵黃膜光潔、完整，卵清殘留量少，有利于進(jìn)一步的分離純化。 3、水稀釋法去脂效果好，若進(jìn)一步經(jīng)硫酸銨鹽析后

9、，蛋白回收率約為40％。如能進(jìn)一步優(yōu)化條件，經(jīng)嗜硫色譜、疏水色譜及凝膠層析等方法純化抗體，有望得到純度更高的抗體。 4、經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定，所制雙價(jià)抗蛇毒IgY與舟山眼鏡蛇、眼鏡王蛇反應(yīng)最明顯，反應(yīng)沉淀線最清晰，與眼鏡蛇亞科和蝰蛇亞科的部分蛇毒有強(qiáng)弱不等的交叉反應(yīng)；與蝮蛇亞科的蝮蛇、尖吻蝮等部分蛇毒無(wú)明顯交叉反應(yīng)。 5、根據(jù)卵黃膜溶膜檢測(cè)儀的時(shí)間結(jié)果證明，一定量的水提物抗蛇毒IgY完全能對(duì)抗眼鏡蛇、蝰蛇毒對(duì)卵黃膜的溶膜

10、作用。 6、體外中和實(shí)驗(yàn)表明，一定濃度的水提物抗蛇毒IgY可以完全保護(hù)實(shí)驗(yàn)小鼠免受2倍LD50眼鏡蛇、蝰蛇毒的攻擊。 7、不同濃度劑量的抗蛇毒IgY能對(duì)眼鏡蛇、蝰蛇傷小鼠有不同程度的保護(hù)作用；當(dāng)IgY劑量足夠高時(shí)，能夠完全保護(hù)小鼠免受眼鏡蛇、蝰蛇毒的攻擊。 結(jié)論： 1、以眼鏡蛇、蝰蛇毒粗毒免疫萊杭母雞，經(jīng)初次小劑量、間歇、逐漸加量加強(qiáng)免疫，可持續(xù)數(shù)周獲得含有高效價(jià)、特異性抗體的雞卵黃抗體。 2、自