1、對蝦白斑綜合癥(White Spot Syndrome，WSS)是目前危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)最為嚴重的病害之一，在世界范圍內己造成了巨大經濟損失，但目前仍未得到有效的防治。因此，尋找一種安全、簡便、高效的防治方法，已成為解決該病害的關鍵。 卵黃免疫球蛋白(Eggyolk immunoglobulin，IgY)可用于治療由細菌或病毒等多種病原體引起的人類及動物疾病，具有安全無殘留、不產生抗藥性、方便易得、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，特別是可以應對復雜

2、的水體環(huán)境，針對性地使無脊椎動物獲得被動免疫保護，在防治一些水產動物疾病方面，具有廣闊的應用前景。 本研究對WSSV進行了擴增、分離、鑒定，以其DNA為模板，利用PCR技術分別釣取WSSV的主要致病蛋白基因VP28、VP19、VP15，并設計兩條連接肽GGDAGD和GNSPNA，通過重疊延伸PCR技術將三段基因串聯(lián)構成融合基因。將這些目的基因與真核表達載體pCI連接構建單一基因重組質粒pCI-28、pCI-19、pCI-15以及

3、融合基因重組質粒pCI-28-19-15。通過原核細胞誘導表達和轉染HeLa細胞使其表達目的蛋白，運用Western Blotting及間接免疫熒光反應檢測DNA疫苗的免疫原性。結果表明，目的基因能夠進行表達，并能夠特異性的識別WSSV抗體。從而，證明了WSSV的DNA疫苗具有良好的免疫原性，可以表達出目的蛋白并對相應的抗體進行識別，為其作為抗原免疫蛋雞奠定基礎。 以WSSV病毒滅活疫苗為對照，將上述制備的DNA疫苗作為抗原，胞

4、嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的寡核苷酸鏈(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODNs)作為DNA疫苗佐劑免疫蛋雞，獲取抗WSSV特異性卵黃抗體。通過間接ELISA法監(jiān)測抗體活性，結果表明，CpG佐劑能夠顯著增強DNA疫苗的免疫性能(P<0.05)；以不同的抗原免疫蛋雞均可獲得特異性卵黃抗體，特異性IgY在110天仍保持較高的抗體活性；滅活疫苗組及DNA疫苗組的抗體活性與陰性對照組均有顯著差異(P<0.05)。

5、融合基因DNA疫苗與單一基因DNA疫苗免疫產生的特異性IgY活性之間無顯著差異；單一基因DNA疫苗免疫效果與其混合交叉免疫的效果也無顯著差異； 采用水稀釋，兩步鹽析，超濾法從卵黃中分離純化IgY，平均每枚蛋黃可以獲得120mg以上的IgY，特異性IgY含量隨時間變化趨勢可以反映出抗體活性的變化。不同疫苗的抗體產物的總IgY含量基本一致；而特異性IgY含量則不同，DNA疫苗獲得的抗體產物中特異性IgY含量明顯高于對照，低于滅活疫苗

6、。 使用制備的IgY蛋白粉和卵黃粉，通過注射、口服、浸泡等方式系統(tǒng)地考察了抗WSSV的特異性卵黃抗體對實驗動物被動免疫保護效果。體外中和注射實驗結果表明，特異性IgY能夠一定程度上抑制WSSV；在口服被動免疫實驗中，1％滅活疫苗IgY蛋白粉的保護效果最佳，累計死亡率53.3％，口服10％滅活疫苗卵黃粉的保護效果其次，累計死亡率為66.7％；浸泡被動免疫實驗中，滅活疫苗IgY浸泡組的死亡率為33.3％，DNA疫苗IgY浸泡處理組累