1、特異性卵黃抗體，即卵黃免疫球蛋白(ImmunoglobulinYolk，IgY)，在防治由細菌或病毒感染引起的動物性疾病方面具有安全無殘留、不產生抗藥性、特異性強等特點，已引起研究者的廣泛關注。有研究表明，口服的特異性IgY（在消化道黏液的作用下易被分解）在不與病原菌直接接觸的情況下，對細菌感染引起的非消化道疾病起到了顯著的治療作用，據(jù)此，研究者推測IgY在體內可能以活性片段的形式與病原菌特異性結合，抑制病原菌在病灶處的定植與繁殖，從而

2、發(fā)揮治療疾病的作用。本研究分別采用體外酶解法和基因工程重組表達法制備特異性IgY活性片段，向其中加入熒光識別位點，以期借助體內熒光示蹤技術考察特異性IgY活性片段在體內的走向及分布，從而為研究口服特異性IgY治療非消化道疾病的作用機理提供實驗材料和理論依據(jù)。
　　體外酶解法采用嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫蛋雞，制備IgY及其活性片段。間接ELISA表明，IgY的最高效價可達1∶51200;經(jīng)兩步鹽析，IgY的純度由原來的30.5％提高

3、到62.2％。免疫熒光和體外抑菌實驗表明，特異性IgY與嗜水氣單胞菌的結合為特異性結合。胃蛋白酶酶解IgY的SDS-PAGE和間接ELISA顯示，胃蛋白酶作用于IgY24h能夠將IgY徹底分解成Fab'和pFc'碎片;Westernblot和體外抑菌實驗結果表明特異性IgY酶解組分中的Fab'為IgY活性片段，其具有顯著的體外抑菌性能。
　　基因工程重組表達法以金黃色葡萄球菌為抗原，免疫蛋雞，采集血液，合成cDNA，根據(jù)Geneb

4、ank報道的雞IgY可變框架區(qū)的序列分別設計IgY重、輕鏈可變區(qū)引物，PCR釣取IgY重、輕鏈可變區(qū)基因，基因測序，結果表明，重鏈可變區(qū)的片段大小約為390bp;輕鏈可變區(qū)均約為330bp。采用生物信息學方法對所得序列與現(xiàn)已報道的相關基因序列進行比較，初步篩選出4條特異性IgY可變區(qū)序列，VH2和VH7及VL1和VL4，分別連接pET28a載體，構建重組菌，IPTG誘導，結果發(fā)現(xiàn)VH2和VH7的誘導表達成功，且在EcoliBL21中的表

5、達均為胞內可溶性表達;與對照組相比，VH2和VH7均具有顯著地結合金黃色葡萄球菌的能力，且VH7的抗原結合活性顯著高于VH2(P＜0.05)。采用體外酶解法制備的特異性IgY酶解組分中含非特異組分，這將會干擾后續(xù)實驗，因此，本研究更傾向于用基因工程重組表達法制備特異性IgY活性片段。
　　綜上，酶解法制備的特異性IgY酶解組分中具有體外抑菌活性和抗原結合活性的活性片段為Fab';基因工程重組表達法成功表達出兩個特異性IgY活性片段