1、近20年來，對蝦白斑綜合癥病毒病一直是業(yè)內(nèi)研究的熱點。從最初的形態(tài)學(xué)觀察，到各種抗病毒免疫相關(guān)基因的鑒定，都傾注了研究者們的大量心血。但是到目前為止這個“謎團”似乎還沒有揭開的跡象。我們認(rèn)為免疫反應(yīng)是一個交互作用的復(fù)雜過程，只有從組學(xué)的角度上闡釋對蝦和病毒相互作用的分子機制，深入了解對蝦的抗病毒免疫機理，才能有的放矢地控制病毒的發(fā)生與流行。測序技術(shù)的飛速發(fā)展為我們想法的實現(xiàn)提供了一個良好的平臺。
　　 基于Illumina/So

2、lexa高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠?qū)θ我馕锓N的整體轉(zhuǎn)錄組情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)未知和稀有轉(zhuǎn)錄本，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息;數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)能夠分析不同處理狀態(tài)下的基因表達(dá)水平。與傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比，Illumina/Solexa測序技術(shù)具有高通量，快速和準(zhǔn)確等特點。
　　 本研究以感染W(wǎng)SSV的凡納濱對蝦血淋巴為研究對象，應(yīng)用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)對血淋巴的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測序。使用短序列組裝軟件SOAP

3、denovo對測序結(jié)果進(jìn)行從頭組裝，建立凡納濱對蝦血淋巴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫;將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對、功能注釋和代謝通路分析;利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對WSSV感染早期和晚期的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選;并篩選了部分基因做功能鑒定。取得的結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1、轉(zhuǎn)錄組測序共獲得2，581多萬條90bp的高質(zhì)量配對短序列。采用短序列組裝軟件SOAPdenovo進(jìn)行序列組裝，共獲得52，0

4、73條unigenes，平均長度為520nt，N50值為745nt，測序質(zhì)量評價結(jié)果表明，除了3’端和5’端存在少量reads外，其它reads的分布都相對均一。該研究成果極大地豐富了凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，為發(fā)現(xiàn)新基因及分析差異表達(dá)基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　 2、在組裝獲得的52，073條unigenes中，有23，568條unigenes可以注釋到四個數(shù)據(jù)庫;通過GO功能注釋，共有6，562條unigenes被歸類到50個

5、功能分類中，這些功能分類主要涉及代謝相關(guān)，生長和發(fā)育調(diào)控，凋亡，生物合成，免疫防御，分子加工，信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等;通過COG功能分類，共有7，822條unigenes被歸類到25個功能類別中;通過KEGG代謝通路分析，共有14，941條unigenes注釋到240個信號通路中;CDS預(yù)測表明有20，689條unigenes可以預(yù)測到蛋白編碼框，其余未被預(yù)測到蛋白編碼框的序列用ESTscan軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明有5，669條可能

6、為新的蛋白編碼序列;KEGG分析顯示有963條unigenes被顯著富集到各個免疫相關(guān)的信號通路中，如泛素介導(dǎo)的蛋白酶水解通路，MAPK信號通路，jak-STAT信號通路和鈣代謝信號通路等;從被注釋到的基因中篩選到約有1，179條unigenes與其它物種的免疫相關(guān)基因具有相似性。由以上結(jié)果我們可以推測對蝦的抗病毒免疫系統(tǒng)是一個由多個因子參與，涉及多個信號通路的復(fù)雜的生物反應(yīng)過程。
　　 3、利用DGE測序技術(shù)，分別對LO樣品（

7、對照樣），L1樣品（WSSV感染后5h樣品）和L2樣品（WSSV感染后48h）進(jìn)行分析，三個樣品均獲得約6千萬條高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽;通過測序質(zhì)量分析，測序飽和度和均一度評價，基因覆蓋度分析，表明所獲得的tags可以用作進(jìn)一步的差異表達(dá)基因分析;將三個樣本的tags比對回轉(zhuǎn)錄組，比較分析發(fā)現(xiàn)在病毒感染的早期，僅有315個差異表達(dá)基因，包括227個上調(diào)表達(dá)基因和88個下調(diào)表達(dá)基因;而在病毒感染的晚期，共有4，226個差異表達(dá)基因，包括25

8、06個上調(diào)表達(dá)基因和1720個下調(diào)表達(dá)基因;GO功能注釋表明，這些差異基因分別富集到不可溶解部分，肽酶活性和細(xì)胞氨基酸代謝過程等GO條目中;KEGG代謝通路分析表明，病毒感染晚期的差異表達(dá)基因大多富集到細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，補充和凝固級聯(lián)，抗原加工和遞呈等信號通路中;qRT-PCR實驗驗證表明所選四個基因的表達(dá)模式與DGE的測序結(jié)果趨勢一致。通過以上分析結(jié)果我們可以得知，在病毒感染的早期，對蝦的免疫反應(yīng)是遲緩的，而在病毒感染的晚期，對

9、蝦的免疫系統(tǒng)才被充分激活。
　　 4、在轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜測序結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，選取18個免疫相關(guān)基因，通過分析在嚴(yán)重感染頻死的對蝦血淋巴中這些基因的表達(dá)情況，篩選出6個表達(dá)量與對照組具有顯著性差異的基因。其中胰凝乳樣絲氨酸蛋白酶基因顯著上調(diào)表達(dá)，其余五個基因包括熱激蛋白70，對蝦肽，粘性因子，增殖細(xì)胞核抗原和Argonaute顯著下調(diào)表達(dá);體外合成胰凝乳樣絲氨酸蛋白酶的雙鏈RNA，通過注射方法沉默該基因的表達(dá)，沉默效率實驗