1、膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位之后，其中超過(guò)90％的膀胱癌為尿路上皮癌(UC)，具有易復(fù)發(fā)和進(jìn)展的特點(diǎn)。膀胱癌發(fā)病的具體分子機(jī)制目前尚不明確，與其他惡性腫瘤一樣，膀胱癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過(guò)程，也是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路參與的復(fù)雜過(guò)程。目前膀胱癌發(fā)病、復(fù)發(fā)和進(jìn)展的分子機(jī)制仍然是泌尿外科的研究熱點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)機(jī)制在腫瘤中具有重要作用

2、，其中抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可引起染色體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的改變，導(dǎo)致基因表達(dá)失活，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因的異常甲基化不是隨機(jī)出現(xiàn)的，其具有基因特異性和腫瘤特異性，已在膀胱癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者的組織和血液、尿液等體液中發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因的異常甲基化，同時(shí)其甲基化同腫瘤的分期和分化及預(yù)后相關(guān)，并可能成為腫瘤特異性的分子標(biāo)記物。另外基因啟動(dòng)子甲基化改變不涉及DNA序列的改變，是可逆的，可被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)抑

3、癌基因的表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制細(xì)胞的增值，可能成為腫瘤治療的新途徑。因此，研究膀胱癌中抑癌基因的甲基化對(duì)理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、建立新的腫瘤標(biāo)記物以及預(yù)后分析和治療均具有重要意義。
　　 組蛋白乙?；揎椧彩潜碛^遺傳調(diào)控主要的研究?jī)?nèi)容之一，其通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)型調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，組蛋白乙?；龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，去乙酰化抑制基因轉(zhuǎn)錄。目前研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化同組蛋白乙酰化具有密切關(guān)系，組蛋白去乙酰化是DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄

4、的重要下游機(jī)制之一。組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA可增強(qiáng)表觀抑制的抑癌基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，在腫瘤的表觀遺傳學(xué)治療中具有重要意義。
　　 凋亡蛋白酶活化因子-1基因(Apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)和腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)是兩種重要的抑癌基因，分別在線粒體凋亡途徑和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，而

5、膀胱癌中Apaf-1、APC基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)甲基化特異性PCR方法檢測(cè)膀胱移行細(xì)胞癌組織中Apaf-1和APC的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析兩種抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與膀胱癌臨床特點(diǎn)及復(fù)發(fā)的關(guān)系，并檢測(cè)人膀胱癌T24細(xì)胞株中Apaf-1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，并應(yīng)用不同濃度的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞株

6、進(jìn)行處理，觀察其細(xì)胞生物學(xué)行為改變和Apaf-1基因的表達(dá)情況，鑒于組蛋白乙?；{(diào)節(jié)與啟動(dòng)子甲基化的重要關(guān)系，本研究進(jìn)一步應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(trichostatin A，TSA)體外作用于人膀胱癌T24細(xì)胞株，觀察其細(xì)胞生物學(xué)行為改變和Apaf-1、APC表達(dá)的變化。本研究為探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和建立臨床早期診斷和預(yù)后的標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為膀胱癌的表觀遺傳學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)。本研究分為三個(gè)部分：
　

7、　 第一部分：膀胱癌抑癌基因Apaf-1和APC的甲基化狀況及其臨床意義。
　　 目的：研究抑癌基因細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(APC)的啟動(dòng)子甲基化狀況與膀胱癌臨床病理的關(guān)系及對(duì)患者復(fù)發(fā)的影響。
　　 方法：采用甲基化特異性PCR方法檢測(cè)110例膀胱癌組織中Apaf-1和APC的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，以15例正常膀胱黏膜組織為對(duì)照組。
　　 結(jié)果：Apaf-1和APC基因在膀

8、胱癌組織中的甲基化率為90.0％和82.7％，在正常膀胱組織為6.77％和20.0％，差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000)。膀胱癌中Apaf-1及APC基因的甲基化率隨腫瘤分級(jí)、分期的增加而升高，而不同性別、不同年齡以及腫瘤單發(fā)與多發(fā)之間的比較分別無(wú)顯著性差異(P均＞0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Apaf-1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P＜0.05)。在復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的比較中，Apaf-1的甲基化陽(yáng)性率分別為97

9、.6％(41/42)和85.3％(58/68)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.382，P=0.036)，而APC的甲基化率分別為85.7％(36/42)和80.9％(55/68)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.424，P=0.515)。
　　 結(jié)論：Apaf-1及APC基因啟動(dòng)子甲基化在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，Apaf-1啟動(dòng)子甲基化可能成為膀胱癌患者預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。
　　 第二部分：5-氮雜-2，-脫氧

10、胞苷對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞系增殖及Apaf-1基因表達(dá)的影響。
　　 目的：觀察5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響及對(duì)Apaf-1基因表達(dá)的影響。
　　 方法：甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)膀胱癌T24細(xì)胞株中Apaf-1基因的甲基化狀態(tài)；應(yīng)用不同濃度的5-Aza-CdR處理人膀胱癌T24細(xì)胞，噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化

11、情況；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)Apaf-1基因mRNA水平改變；Westernblot法檢測(cè)Apaf-1蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：T24細(xì)胞Apaf-1基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)；5-Aza-CdR對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，5-Aza-CdR作用后T24細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡率明顯增加。5-Aza-CdR處理組中Apaf-1基因的mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加。
　　 結(jié)論：T2

12、4細(xì)胞Apaf-1基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)，5-Aza-CdR可增強(qiáng)Apaf-1基因的表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡和周期阻滯抑制T24細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 第三部分：曲古抑菌素A對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖及Apaf-1和APC基因表達(dá)的影響。
　　 目的：研究組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(TSA)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)Apaf-1、APC基因表達(dá)的影響。
　　 方法：采用3×104 mmol/L T

13、SA作用T24細(xì)胞，MTT法檢測(cè)TSA對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)TSA作用前后T24細(xì)胞周期和凋亡的變化；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)TSA作用前后膀胱癌細(xì)胞中Apaf-1、APC mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：TSA對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用；TSA作用后T24細(xì)胞的G0/G1期比例增加，S期比例減少，細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示TSA處理能明顯誘導(dǎo)