1、為解決綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情問(wèn)題，曾嘗試應(yīng)用前期構(gòu)建的抑制素(INH)基因疫苗免疫綿羊，在非繁殖季節(jié)雖能促進(jìn)促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)激素分泌和卵泡發(fā)育，但未能誘導(dǎo)發(fā)情排卵，推測(cè)與 GnRH、LH的脈沖頻率和濃度低有關(guān)。促性腺激素抑制激素（GnIH）是唯一被闡明對(duì)GnRH、LH起著負(fù)調(diào)控作用的神經(jīng)肽，在非繁殖期抑制動(dòng)物的繁殖功能。這為運(yùn)用生殖免疫原理中和GnIH，調(diào)節(jié)GnRH、LH激素水平，誘導(dǎo)綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情提供契機(jī)。因此本研究

2、旨在建立GnIH抗體間接ELISA檢測(cè)方法，構(gòu)建GnIH-INH-Follistatin融合基因疫苗，研究免疫后非繁殖季節(jié)綿羊生殖激素表達(dá)規(guī)律，為非繁殖季節(jié)開(kāi)展多胎免疫工作提供理論和技術(shù)支撐。
　　1.GnIH抗體間接ELISA方法的建立及優(yōu)化
　　以純化的GnIH（1～28a）合成多肽為包被抗原，成功建立檢測(cè)GnIH抗體的間接 ELISA檢測(cè)方法：包被液的最適濃度為0.4 ug/ml，選擇5％脫脂奶粉作為最適封閉液，確定了

3、酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1:20000，以60 min作為樣品的最適反應(yīng)時(shí)間。酶標(biāo)抗體作用時(shí)間為60 min，最佳顯色時(shí)間為15 min，該方法重復(fù)性較好，可用于GnIH疫苗免疫后抗體滴度的檢測(cè)。對(duì)人工合成GnIH多肽表位疫苗（免疫劑量：300 ug/ml，免疫次數(shù)：2次）綿羊不同階段的抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5周后抗體均上升到最高值，表明GnIH（1～28a）具有較好的免疫原性，可作為GnIN-INH基因疫苗的備選B細(xì)胞抗原表位
　　

4、2.GnIN-INH-Follistatin融合抗原表位的克隆及表達(dá)
　　采用人工合成方法合成INHα（1～32）、牛GnIH（1～28a）、Follistatin（305～314）和綿羊C3d基因片段，插入克隆載體 pMD18，然后亞克隆至原核表達(dá)載體 pET28a中，然后用BamHI、XhoI同尾酶克隆技術(shù)，分別構(gòu)建 GnIN-INH-Follistatin-3(C3d)、INH-3(C3d)融合的 pET28a-GnIN-I

5、NH-Follistatin-3(C3d), pET28a-INH-3(C3d)原核表達(dá)載體。IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)INH-3(C3d)融合蛋白，但 GnIN-INH-Follistatin-3(C3d)融合蛋白未能成功誘導(dǎo)，還需進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)程序。
　　3.GnIH-INH-Follistatin融合基因疫苗構(gòu)建
　　GnIN-INH-Follistatin-3(C3d)融合的 PET28a-GnIN-INH-Follist

6、atin-3(C3d)原核表達(dá)載體為基礎(chǔ)，將 GnIN-INH-Follistatin-3(C3d)轉(zhuǎn)入真核疫苗表達(dá)載體 pSEC-tag2a中構(gòu)建 pSEC-tag2a-GnIN-INH-Follistatin-3(C3d)基因疫苗。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，做采用 takara的熒光定量 PCR用2X premix對(duì)基因進(jìn)行 RT-PCR試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，表明pSEC-tag2a-GnIN-INH-Follis

7、tatin-3(C3d)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞后能夠在 HEK293細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
　　4.非繁殖季節(jié)GnIH-INH-Follistatin融合基因疫苗主動(dòng)免疫對(duì)綿羊生殖激素的影響
　　在非繁殖季節(jié)（2月份）對(duì)經(jīng)產(chǎn)綿羊（2-3歲）進(jìn)行基因免疫試驗(yàn)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)抗 GnIH抗體和不同時(shí)期血清中激素水平。GnIH-INH融合基因疫苗主動(dòng)免疫后其抗體水平上升，于免疫后第28天達(dá)到最高峰（OD:1.207

8、3±0.64）。免疫后，促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）平均含量均高于對(duì)照組。表明GnIH-INH融合基因疫苗不僅可促進(jìn)FSH分泌，而且可顯著提高綿羊在非繁殖季節(jié)的LH水平。
　　綜上所述，本試驗(yàn)建立了GnIH抗體間接ELISA檢測(cè)方法，成功的構(gòu)建了GnIH-INH融合原核表達(dá)載體、基因疫苗。非繁殖季節(jié)GnIH-INH融合基因疫苗主動(dòng)免疫綿羊后，促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）平均含量顯著提高。表明GnIH-INH融合基因