1、NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的蛋白表達產(chǎn)物是1993年是由Kjeldsen等人在中性粒細胞中首先發(fā)現(xiàn)的。有關NGAL基因在各種組織中的表達及其生物學功能一度成為人們研究的熱點。近年來越來越多的研究表明,NGAL基因在腫瘤組織中不僅呈現(xiàn)高表達,而且還參與癌細胞的侵襲與不良分化。但是關于NGAL基因的表達調(diào)控機制目前尚不甚明了。針對于此,我們在肺癌細胞系中深入研究了NG

2、AL基因的基礎表達調(diào)控機制。這將有助于從分子水平上促進肺癌發(fā)生發(fā)展機制的研究;同時也會對研究NGAL基因在其它腫瘤細胞中的表達調(diào)控機制具有指導意義。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.運用免疫組織化學技術對肺腺癌、鱗癌、肺泡癌等23例肺癌組織切片中NGAL基因的表達情況進行檢測分析。
　　2.利用RT-PCR和免疫熒光的方法,分別在RNA和蛋白水平檢測NGAL基因在肺癌細胞系95D和A549細胞中的表達情況。
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3、.運用PCR缺失、突變及定點突變的方法構建一系列NGAL基因的熒光素酶報告基因表達載體,然后進行瞬時轉染,檢測在關鍵調(diào)控元件缺失或突變之后的相對熒光素酶活力,確定NGAL基因的核心啟動子區(qū)。
　　4.應用生物信息學方法預測與NGAL基因核心啟動子區(qū)相互作用的潛在的轉錄因子。
　　5.運用蛋白印跡技術檢測NGAL基因的潛在的轉錄因子在上述兩種肺癌細胞系中的表達情況。
　　6.設計、合成寡核苷酸探針,利用凝膠滯留技術研究確

4、定 NGAL基因啟動子區(qū)調(diào)控元件與肺癌細胞核蛋白的結合情況;利用凝膠超滯留技術研究確定肺癌細胞中與 NGAL基因啟動子區(qū)調(diào)控元件具有結合能力的轉錄因子。
　　研究結果:
　　1.免疫組化檢測結果表明,肺癌組織中NGAL陽性著色的比例為82.61％(19/23)。肺腺癌、鱗癌組織細胞中可見NGAL中等強度的陽性著色分布于整個細胞胞漿。提示在肺癌組織中有NGAL基因的顯著表達。
　　2.RT-PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),在肺

5、癌細胞系95D和A549細胞中存在著NGAL基因的表達。
　　3.構建了一系列的NGAL基因的報告基因表達載體。檢測結果表明,NGAL基因在肺癌細胞系中的核心啟動子區(qū)為-152~-141,而-106~-79區(qū)間是NGAL基因的最小功能啟動子區(qū)。
　　4.生物信息學預測顯示,與NGAL基因-152~-141區(qū)段相結合的轉錄因子可能是C/EBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)家族成員;而與NG

6、AL基因-106~-79區(qū)段相結合的可能是MRFs(Myogenic Regulatory Factors)家族成員。
　　5.進一步的蛋白印跡技術檢測發(fā)現(xiàn),在肺癌細胞系中僅有上述兩個家族中的C/EBPβ和MyoD、Myf5的表達。
　　6.凝膠滯留實驗發(fā)現(xiàn),在肺癌細胞的核蛋白中確實存在著能夠與NGAL基因調(diào)控序列相結合的成分。進一步的超滯留實驗結果表明,與NGAL基因調(diào)控序列結合的轉錄因子分別是C/EBPβ和MyoD。