1、在不同條件下對(duì)耐藥大腸桿菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，考察耐藥菌對(duì)不同氟喹諾酮類(lèi)藥物（FQs）敏感性恢復(fù)中的差異，以及 Plassmid-mediated quinolone resistance（PMQR）耐藥基因和 gyrA基因在傳代前后是否發(fā)生變化。分析適合度代價(jià)對(duì)耐藥大腸桿菌敏感性恢復(fù)的影響，以研究耐氟喹諾酮類(lèi)藥物大腸桿菌敏感性恢復(fù)的條件及機(jī)制。尋找耐藥細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性恢復(fù)的方法，為降低或消除細(xì)菌耐藥性對(duì)人的健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的危害提供幫助。

2、
　　1、將對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和萘啶酸等6種喹諾酮類(lèi)藥物高度耐藥的4株野生型大腸桿菌（E1、E2、E4、E7），在無(wú)藥營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每天傳代2次，連續(xù)傳代80天，共計(jì)傳代約480代，設(shè)3個(gè)重復(fù)；每5天測(cè)定一次6種藥物對(duì)傳代菌株的MIC值，觀察傳代對(duì)細(xì)菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：經(jīng)480代傳代后環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星對(duì)E1、E2、E4、E7的MIC值均有一定程度

3、的下降，但仍處于高度耐藥水平，其中對(duì)環(huán)丙沙星的MIC平均降幅最大（為4.8倍）；萘叮酸對(duì)4株菌的MIC值未發(fā)生變化。結(jié)論：對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物高度耐藥的野生型大腸桿菌在普通傳代條件下其敏感性難以恢復(fù)，尤其是萘叮酸，建議在已經(jīng)耐藥的養(yǎng)殖場(chǎng)中不再使用該藥。
　　2、無(wú)藥營(yíng)養(yǎng)肉湯用生理鹽水稀釋8倍、16倍和32倍后，將4株野生型耐藥大腸桿菌分別在其中傳代培養(yǎng)，每天傳代2次，連續(xù)傳代60天，共計(jì)傳代約398代；每5天檢測(cè)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾

4、氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星對(duì)傳代菌株的MIC值，觀察營(yíng)養(yǎng)匱乏因素對(duì)細(xì)菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：環(huán)丙沙星對(duì)四株耐藥大腸桿菌的平均MIC由傳代前的96μg/mL降低到了傳代后的7μg/mL，MIC值的降幅最大，敏感性恢復(fù)最為顯著；其次是諾氟沙星和氧氟沙星，分別由傳代前的64μg/mL和40μg/mL降低到了傳代后的11μg/mL和16μg/mL；而恩諾沙星和洛美沙星的敏感性雖有所恢復(fù)，但均未恢復(fù)至敏感或中介水平。結(jié)論：在不同的營(yíng)養(yǎng)水平

5、條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，耐藥菌對(duì)不同氟喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性恢復(fù)存在差異，其中環(huán)丙沙星的敏感性最容易恢復(fù)，其次是諾氟沙星和氧氟沙星，耐藥菌對(duì)恩諾沙星和洛美沙星的敏感性難以恢復(fù)至敏感或中介水平。
　　3、對(duì)4株耐藥大腸桿菌與一株敏感大腸桿菌的菌液分別按7/3、5/5和3/7的比例混合后在無(wú)藥培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，共3個(gè)重復(fù)，每天傳代2次，連續(xù)傳代60天，共計(jì)約398代；每隔5天檢測(cè)上述五種氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)傳代菌株的MIC值，以觀察生存競(jìng)爭(zhēng)因素

6、對(duì)細(xì)菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：5種藥物對(duì)混合培養(yǎng)菌群的MIC值均降低，環(huán)丙沙星、諾氟沙星較于恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星更容易恢復(fù)至敏感或中介水平；并且混合培養(yǎng)菌液中敏感菌比例越高，其敏感性恢復(fù)越容易。結(jié)論：敏感細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)耐藥菌群的敏感性恢復(fù)有重要的影響。
　　4、將對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物表現(xiàn)為敏感的野生型大腸桿菌 E685、E714、E746進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥后，得到相對(duì)應(yīng)的耐藥菌株R685、R714、R746。將R685、R714

7、、R746中混入少量敏感菌后連續(xù)傳代培養(yǎng)，共3個(gè)重復(fù)，每天傳代2次，總共傳代240代，每隔5天測(cè)定五種氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)傳代菌株的MIC值，得到敏感性恢復(fù)的菌株C685、C714、C746。并測(cè)定和繪制E714、R714、C714菌株在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：R685、R714、R746等3株誘導(dǎo)耐藥菌株中R714連續(xù)傳代后（即C714），5種藥物對(duì)其MIC值降低速度最快、降幅最大，在傳代150代后，恩諾沙星對(duì)C714的MIC值降

8、低到中介水平，其余四種藥物對(duì)C714的MIC則均降為敏感水平；而C685和C746對(duì)諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星的MIC值降為敏感或中介水平，但對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星仍表現(xiàn)為耐藥。結(jié)論：與野生型高度耐藥大腸桿菌的敏感性恢復(fù)相比，短期誘導(dǎo)耐藥的菌株其敏感性更容易得到恢復(fù)。并且耐藥菌的生長(zhǎng)速率較敏感菌低，細(xì)菌獲得耐藥性后可能會(huì)增加其生存適合度代價(jià)，而使其在無(wú)藥環(huán)境的生存競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)。
　　5、應(yīng)用 PCR方法對(duì)試驗(yàn)菌傳代前后的PMQR

9、耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，考察耐藥水平變化后耐藥基因的攜帶情況。結(jié)果：在普通條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代前后的試驗(yàn)菌內(nèi)PMQ R耐藥基因的表型未見(jiàn)變化,這與它們耐藥水平未發(fā)生變化相一致；在營(yíng)養(yǎng)匱乏因子脅迫下傳代，E2、E4、E7出現(xiàn)qnrB和aac(6‘)-Ib-cr耐藥基因的丟失，與其敏感性得到恢復(fù)結(jié)果相一致；在不同的耐藥/敏感菌比例下傳代：E2、E7菌株qnrB耐藥基因丟失，E2、E4、E7菌株aac(6‘)-Ib-cr耐藥基因丟失，與其敏感性

10、得到恢復(fù)結(jié)果相一致。誘導(dǎo)耐藥菌株（R685、R714、R746）在耐藥菌/敏感菌比例為95/5的條件下傳代，C714出現(xiàn)qnrB、aac(6‘)-Ib-cr和qepA耐藥基因的丟失，C685出現(xiàn)qnrB耐藥基因的丟失，與其敏感性回復(fù)結(jié)果相一致。結(jié)論：qnrB、aac(6‘)-Ib-cr和qepA耐藥基因在耐藥大腸桿菌的傳代過(guò)程中容易發(fā)生丟失，它們的丟失與對(duì)耐藥菌的敏感性恢復(fù)起著重要的作用。
　　6、通過(guò)基因測(cè)序分析試驗(yàn)菌株gyr