1、目的:
　　 利用角膜緣干細胞體外模型和Ins2Akita糖尿病小鼠模型,研究高糖環(huán)境對角膜緣上皮干細胞活性以及角膜上皮修復(fù)的影響。
　　 方法:
　　 1.采用小鼠角膜緣上皮干/祖細胞系(TKE2)作為體外細胞模型,在培養(yǎng)基中添加終濃度為30mM的葡萄糖進行處理,模擬糖尿病角膜病變的高糖微環(huán)境,通過相差顯微鏡觀察、MTT、干細胞克隆形成、AnnexinV-PI和8-OHdG(DNA單鏈斷裂標記)免疫染色等實驗,

2、觀察高糖環(huán)境對角膜上皮干細胞形態(tài)變化、克隆形成能力、細胞增殖、凋亡、DNA穩(wěn)定性等方面的影響。
　　 2.選擇同齡成年雄性C57BL/6小鼠(正常對照組)和Ins2Akita小鼠(糖尿病組)各10只,比較2組小鼠在體重、血糖水平的差異;刮除小鼠角膜中央2mm的上皮,觀察并比較角膜上皮在損傷后0h、24h、48h、64h、76h、88h、100h、136、172h的修復(fù)情況,并通過透射電鏡、HE..染色、TUNEL(凋亡)標記染色

3、、8-OHdG對角膜上皮的形態(tài)改變、細胞凋亡及DNA穩(wěn)定性進行檢測分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外細胞模型的結(jié)果顯示,高糖處理后的TKE2細胞呈長梭形,隨著高糖處理時間的延長,細胞狀態(tài)變差;高糖組干細胞克隆直徑較小,克隆形成率明顯降低(正常組為28.333±5.508,高糖處理3代TKE2克隆形成率為6.333±1.155),比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);MTT檢測發(fā)現(xiàn),正常組和高糖處理1代細胞間增殖能力有差異(

4、P72h=0.013),高糖處理3代后差異更為明顯(P72h=0.000);細胞凋亡檢測示正常組早期凋亡細胞比例為8.02±3.14,高糖組早期凋亡細胞比例為33.13±2.63,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);高糖處理3代后的細胞8-OHdG陽性染色較正常細胞明顯增強。
　　 2.Ins2Akita糖尿病小鼠在8周的檢測周期內(nèi),其體重增加與正常小鼠相比明顯減少,血糖維持在相對穩(wěn)定的高水平;糖尿病組小鼠的角膜上皮愈合時間為刮

5、除后172h,愈合速度較正常對照組(48h)明顯延遲,并且在88h出現(xiàn)缺損面積的擴大;電鏡觀察顯示,糖尿病小鼠角膜上皮細胞表面微絨毛和微皺褶明顯減少,角膜基底層上皮細胞排列尚規(guī)則,但細胞體積增大,基底細胞空泡化明顯,細胞間橋粒連接較少,角膜上皮與基底膜間的半橋粒明顯減少;HE..染色示糖尿病小鼠角膜上皮細胞表面不平整,形態(tài)不規(guī)則,細胞間連接疏松,細胞層數(shù)減少,分界不清,角膜上皮層基底細胞空泡形成,基質(zhì)層明顯水腫;TUNEL結(jié)果示角膜上皮

6、基底層細胞TUNEL標記染色較正常組明顯增多;8-OHdG的染色結(jié)果示角膜上皮基底層細胞8-OHdG標記染色陽性細胞較正常對照組明顯增多。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外高糖處理條件下,角膜上皮干細胞的形態(tài)發(fā)生改變,角膜上皮干細胞的克隆形成能力和增殖明顯受到抑制;早期凋亡細胞明顯增多;基因組穩(wěn)定性下降。
　　 2.Ins2Akita糖尿病小鼠角膜上皮修復(fù)速度明顯減慢,并出現(xiàn)反復(fù)剝脫現(xiàn)象;角膜基底層的上皮細胞形態(tài)變化