1、目的角膜緣干細胞缺損時，角膜上皮細胞不能自我更新，結膜上皮侵入角膜表面，這種結膜化的過程會使角膜上皮變得異常且不規(guī)則，并伴有繼發(fā)的新生血管化，持續(xù)的上皮缺損，基質潰瘍，瘢痕化，潛在的穿孔，慢性疼痛及視力喪失。角膜緣干細胞缺損的治療非常棘手。以抑制炎癥反應、防止感染、減少瞼球粘連等為目的的保守療法和傳統(tǒng)的穿透或板層角膜移植等手術治療方法的效果均很差。角膜緣干細胞移植被認為是一種促進角膜損傷愈合，穩(wěn)定角膜表面，修復角膜上皮糜爛和持續(xù)性上皮缺

2、損，減少角膜新生血管侵入，阻止假性胬肉形成，增進視力，提高角膜移植成功率的有效方法。自體角膜緣移植不存在免疫排斥反應，術后效果好，但只適用于單眼角膜緣受損或雙眼局限性受損的患者，臨床應用有一定的局限性。同種異體角膜緣移植存在免疫排斥反應，常致手術失敗。 羊膜上皮細胞(Amniotic epithetical cells)是胚胎發(fā)育的早期產物，所以其中可能含有多潛能干細胞。保存羊膜的上皮細胞已經死亡，新鮮羊膜的上皮細胞與基底膜結合

3、緊密，兩者都不易發(fā)揮其干細胞的功能，于是我們將人羊膜上皮細胞分離并于體外進行大量增殖培養(yǎng)，并以去上皮羊膜為載體移植治療兔角膜堿燒傷所致的角膜緣干細胞缺損，通過與單純去上皮羊膜移植比較治療效果，探討該手術方法的安全性和有效性，為嚴重角膜緣干細胞缺損的臨床治療提供新的思路。 方法堿燒傷模型的制作方法參照’Fseng等人建立的方法進行改進，通過板層切除角膜緣聯(lián)合NaOH燒傷角膜來達到制作目的。羊膜經EDTA處理后去除其上皮細胞。分離，

4、去除殘留的絨毛膜，PBS洗盡血跡后用0.125﹪胰酶(typsine)37℃消化15分鐘，重復4次，1000rpm離心6分鐘收集羊膜上皮細胞，用PBS洗三次后接種在含DEME培養(yǎng)皿中，于3 7℃含5﹪二氧化碳的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)兩周后接種于去上皮羊膜上，常規(guī)培養(yǎng)兩周后行移植手術。將單眼堿燒傷模型兔18只隨機分為對照組(control group)，單純羊膜移植組(AM group)和人羊膜上皮細胞羊膜移植組(AM+cell grou

5、p)，每組6只兔6眼，移植手術于燒傷后四周進行，并對治療后的角膜進行裂隙燈觀察，病理學和免疫組化檢測。 結果消化、分離的HAECs于2-3天內貼壁，15×15cm<'2>大小的羊膜大約可以收獲1×10<'6>個細胞。貼壁生長的羊膜上皮細胞一般成簇生長，呈圓形、多角形，核較大，胞漿中含有特征性的空泡狀的脂肪滴。2—3周傳代一次．人羊膜上皮細胞羊膜移植組治療后角膜基本保持透明，新生血管細小，未見結膜上皮長入；病理學檢查可見與正常角膜

6、類似的復層上皮，未見明顯的杯狀細胞和新生血管；AE-5染色陽性。單純去上皮羊膜移植治療后角膜混濁，結膜上皮長入，新生血管較粗大多見；病理學檢查可見排列不規(guī)則的復層上皮細胞，夾雜較多杯狀細胞，可見炎性細胞，紅細胞和新生血管，AE-5染色陰性。對照組大部分角膜上皮脫落，杯狀細胞彌漫分布，炎性細胞浸潤，大量新生血管向角膜中央生長，AE-5陰性。 結論采用消化培養(yǎng)法可獲得人羊膜上皮細胞。通過板層切除角膜緣聯(lián)合氫氧化鈉燒傷角膜可以建立角膜