1、[目的]構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動(dòng)子區(qū)(BCP)1762／1764雙突變株的復(fù)制質(zhì)粒。定量檢測(cè)未發(fā)生肝癌的慢性乙型肝炎病人和己發(fā)生肝癌的慢性乙肝病人血清和肝組織中乙型肝炎病毒BCP區(qū)A1762T／G1764A雙突變,探討此雙突變和肝癌的關(guān)系及意義。
　　 [方法]
　　 (1)利用已有1.5拷貝HBV野生型全基因組序列質(zhì)粒(pHBV1.5,C型)為模板,采用分子克隆、大引物定點(diǎn)突變方法構(gòu)建BCP區(qū)A1762T／G

2、1764A雙突變重組質(zhì)粒。
　　 (2)將野生株重組質(zhì)粒和雙突變重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HepG2.0細(xì)胞,測(cè)定其細(xì)胞培養(yǎng)液HBV DNA和HBsAg水平來測(cè)定雙突變質(zhì)粒的復(fù)制能力和蛋白表達(dá)能力。
　　 (3)以野生株重組質(zhì)粒和雙突變重組質(zhì)?；蛐蛄性O(shè)計(jì)特異性TaqMan MGB探針。
　　 (4)采用特異性探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(PSRT-PCR)方法準(zhǔn)確檢測(cè)樣本雙突變。
　　 (5)對(duì)比野生株重組質(zhì)粒和雙突

3、變重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后的復(fù)制能力；比較雙突變?cè)谖窗l(fā)生肝癌的慢性乙型肝炎病人和已發(fā)生肝癌的慢性乙肝病人血清和肝組織中的發(fā)生情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和Cochra-Cox近似t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法、x2檢驗(yàn)。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)成功構(gòu)建BCP區(qū)A1762T／G1764A雙突變復(fù)制質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)后測(cè)定HBV DNA水平,雙突變株復(fù)制能

4、力高于野生株[(3.29±1.27×105copies／ml)vs(1.24±0.24×105copies／ml)]。
　　 (2)成功制作用于同時(shí)檢測(cè)HBV DNA和雙突變拷貝量的。TaqMan MGB探針。
　　 (3)成功使用PSRT-PCR方法快速、特異、準(zhǔn)確檢測(cè)乙肝病毒HBV BCP區(qū)A1762T／G1764A雙突變。
　　 (4)對(duì)從未進(jìn)行抗病毒治療的80例慢性乙肝病人和50例肝癌病人分別予血清和肝組

5、織雙突變定量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)無肝癌慢性乙肝病人組血清突變率為41.25％(33／80),肝組織突變率為45.00％(36／80)；肝癌組血清突變率為68.00％(34／50),肝組織突變率為78.00％(39／50),兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,每組各自血清和肝組織突變率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (5)將無肝癌慢性肝病組分為高病毒載量組(HBV DNA≥106 copies／mL,43例)和低病毒載量組(HBV DNA<106 copies

6、／mL,37例),發(fā)現(xiàn)高病毒載量組血清和肝組織突變率均高于低病毒載量組[分別為58.14％(25／43)對(duì)比21.62％(8／37)與62.79％(27／43)對(duì)比24.32％(9／37)],經(jīng)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)結(jié)果表明,存在BCP區(qū)A1762T／G1764A雙突變的乙肝病毒其復(fù)制能力高于無此突變的野生型病毒。
　　 (2)使用特異性TaqManMGB探針的PSRT-PC

7、R檢測(cè)方法檢測(cè)雙突變具有良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性,達(dá)到臨床檢測(cè)要求。
　　 (3)已發(fā)生肝癌的慢性乙肝病人BCP區(qū)雙突變發(fā)生明顯高于未發(fā)生肝癌者,提示此雙突變和肝癌的發(fā)生密切相關(guān),檢測(cè)此雙突變有助于預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生。
　　 (4)血清檢測(cè)和肝組織檢測(cè)具有良好一致性,對(duì)于無法進(jìn)行肝組織取材的病人檢測(cè)血清可以準(zhǔn)確反映其突變情況,適合臨床推廣應(yīng)用。
　　 (5)未發(fā)生肝癌的慢性乙肝病人病毒載量高提示雙突變發(fā)生率高,及