1、乙型肝炎病毒(HBV)感染的治療藥物研究雖然已經取得一定進展，但如何完全阻斷HBV在體內的復制一直是生物醫(yī)學面臨的重大挑戰(zhàn)?？笻BV藥物已成為當今全球抗病毒藥物研發(fā)的熱點之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，La蛋白(La)具有穩(wěn)定HBVRNA，使其免受核酸酶破壞的作用，引起相關學者的高度關注。La與HBV之間的相互作用研究有許多亟待解決的問題，相關機制的深入探索將為抗HBV藥物研發(fā)提供新的靶點和途徑。 本課題分別在體外轉錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達HB

2、V肝癌細胞中，擬通過研究La及突變體對adr亞型HBVRNA的結合親和力分析、HBV及ORF體外轉錄翻譯的影響，以及細胞內La與HBV復制的關系，探討La及其突變對HBV轉錄、翻譯啟動、HBVRNA穩(wěn)定性、蛋白質表達和病毒復制的影響，并期望通過實驗研究發(fā)現(xiàn)影響HBV復制的關鍵因素，尋找阻斷HBV復制的新的干預方法，為乙型肝炎病毒的防治提供新的策略。研究分為以下三個部分進行。 第一部分人La蛋白及其突變體原核表達質粒的構建和誘導表

3、達純化 本實驗采用定點突變和PCR技術，完成點突變和大片段缺失突變體表達質粒的構建，獲得hLa三個突變體DeL1，DeL2，DeL3真核表達質粒，并在大腸桿菌中融合表達，經親和層析和HPLC純化，實現(xiàn)了野生型hLa及其突變體的誘導表達和純化，為后期實驗研究打下了關鍵基礎。 1.突變體表達質粒的構建野生型hLa表達質粒經測序驗證后，利用PfuUltraHigh-fidelityDNApolymerase完成點突變；合理設計

4、引物，利用PCR技術，進行片段缺失突變。測序結果表明，hLa突變體表達質粒的序列正確，符合實驗設計要求。2.野生型hLa及其突變體表達質粒的誘導表達和純化將經測序分析正確的野生型hLa和突變體的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta2，分別誘導表達，篩選出表達量高的菌種。以50mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4，0.5mol/LNaClpH8.0(1g菌體/20mL)懸浮菌體，超聲破碎，收集上清液。經His親和柱

5、層析純化后的樣品調整pH為5.5，進行離子交換層析純化，以20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH5.5的緩沖液對其進行脫鹽，更換緩沖體系，HPLC進一步純化，收集洗脫峰。蛋白濃度分別為hLa(0.8mg/mL)、DeL1(0.7mg/mL)、DeL2(0.6mg/mL)、DeL3(0.5mg/mL)。 第二部分體外系統(tǒng)中hLa及其突變體對HBV轉錄和蛋白表達的影響 HBV的DNA、RNA等調節(jié)基因區(qū)都有肝細胞

6、蛋白的結合位點。肝細胞蛋白與這些調節(jié)基因之間的結合，調節(jié)HBV的轉錄與基因表達。hLa作為肝臟核提取物的成分之一，對HBV轉錄調節(jié)的作用尚無明確定位。本部分研究采用電泳遷移率變動分析實驗和體外轉錄翻譯體系，研究hLa及其突變體對HBVRNA的遷移率、HBV及ORF體外轉錄和蛋白表達的影響。 1.hLa及其突變體與HBVRNA莖環(huán)結構的結合性分析根據計算機模擬分析預測的結果，經體外轉錄獲得HBV莖環(huán)結構RNA，采用EMSA比較hL

7、a及突變體與HBVRNA莖環(huán)結構的電泳遷移率，分析hLa的位點突變對結合HBVRNA產生的影響。EMSA的結果表明，野生型hLa與HBVRNA莖環(huán)結構的親和力最高；DeL1和DeL3的結合力下降；DeL2幾乎無結合能力。提示，hLa的位點突變不同程度的影響了其與HBVRNA莖環(huán)結構的親和力，影響的程度與突變位點密切相關。 2.hLa及其突變體對HBVRNAs體外轉錄的影響構建adr亞型HBV全基因和4個ORF(pCMVTNT-P

8、、pCMVTNT-全S、pCMVTNT-全C、pCMVTNT-X)真核表達質粒；以線性DNA為模板，利用體外轉錄系統(tǒng)，將hLa及其突變體分別加入各體外轉錄系統(tǒng)中，比較體外轉錄的RNA的完整性和產量，分析hLa及其突變對HBVRNAs體外轉錄的影響。統(tǒng)計分析結果顯示，hLa上調了HBV全基因和P基因的轉錄(P＜0.05)，而在全C基因和X基因的轉錄中分別出現(xiàn)了顯著的促進和抑制作用。DeL1和DeL3對HBV及其ORF的作用未出現(xiàn)明顯的上調

9、和抑制作用，DeL2對HBV全基因和P基因轉錄有較弱的下調作用，但顯著抑制了X基因的轉錄(P＜0.01)，推測hLa的RRM3可能與X基因的轉錄相關。提示hLa對HBV全基因及其ORF轉錄調節(jié)的活性差異可能由各ORFRNA的空間結構的差異所致，也與hLa和HBVRNA的作用部位有關。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，HBV全基因的轉錄優(yōu)于各ORF的轉錄，推測完整的HBV基因組中也可能含有某些活性轉錄調控元件。 3.hLa及其突變體對HBV蛋白表

10、達的影響以“實驗二”中構建的體外轉錄翻譯的真核表達質粒為實驗平臺，將hLa及其突變體分別加至熒光標記的體外翻譯系統(tǒng)中，探討hLa及其突變體等轉錄調節(jié)因子對HBV蛋白翻譯啟動和病毒復制的影響。表達產物分別經SDS-PAGE電泳后，采用Typhoon9400熒光掃描儀檢測結果；常規(guī)轉錄翻譯的產物經電化學發(fā)光法檢測HBsAg和HBeAg的含量。結果發(fā)現(xiàn)，加入hLa后HBsAg表達量明顯上升(P＜0.05)，DeL1對HBsAg的表達量也有上調

11、作用(P＜0.05)，而DeL2和DeL3的作用無統(tǒng)計學差異。全長HBV表達HBeAg的量遠高于C基因的表達量。此外，hLa明顯下調了C基因的表達，而DeL2和DeL3顯著上調C基因的表達，表明DeL2和DeL3中缺失的肽段RRM3和RRM2很可能對全C基因的體外表達有抑制作用。提示，hLa的不同部位或肽段可能對HBVRNA的作用效應不同。 第三部分HepG2.2.15細胞中La對HBV復制和蛋白質表達的影響 1.SiR

12、NA的合成與轉染針對hLamRNA序列設計特異性SiRNA，體外轉錄合成4條La特異性SiRNA，轉染穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞，電化學發(fā)光檢測HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg含量變化。結果表明，HBsAg和HBeAg含量在轉染前3天呈逐漸下降趨勢，而從轉染第5天起，隨著RNA干擾效率的降低，HBsAg和HBeAg含量也隨之升高。提示，細胞內La與HBV蛋白表達有密切關聯(lián)。 2.細胞內La蛋白與H

13、BV蛋白表達和病毒復制的關系SiRNA干擾HepG2.2.15細胞中La的表達，熒光定量PCR檢測LamRNA含量，分析特異性SiRNA對LamRNA的干擾活性；實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA含量變化，分析La與HBV蛋白質表達及病毒復制的相關性。結果顯示：La特異性SiRNA降低了HepG2.2.15細胞中LamRNA的表達。轉染后第3天，與正常培養(yǎng)的細胞相比較，轉染siRNA1的細胞分泌HBsAg下降37.6％，轉染siRNA

14、2的下降23.9％，轉染SiRNA3的下降38.3％；細胞分泌HBeAg分別下降49.4％，30.4％和56％；HBV-DNA分別下降32.9％，18.9％和35.6％。SiRNA3的干擾效率最好。對LamRNA含量變化水平與HBsAg，HBeAg和HBV-DNA的表達水平變化進行相關性分析，結果顯示，HBsAg、HBeAg和HBV-DNA變化水平與LamRNA變化水平的相關系數(shù)分別為0.9382，0.8994，0.7949。表明HBs

15、Ag、HBeAg和HBV-DNA的含量變化水平和LamRNA含量變化水平呈正相關。提示：在細胞水平上，La與HBV蛋白表達和復制有密切關聯(lián)。 結論： 1.本課題針對hLa及突變體與adr亞型HBVRNA的結合作用進行研究。結果發(fā)現(xiàn)：hLa與HBVRNA莖環(huán)結構有親和結合關系，DeL1和DeL3的結合作用減弱，而DeL2顯著降低了結合親和力。提示，hLa的缺失突變影響其與HBVRNA的結合，影響程度與突變部位相關，RRM3

16、可能是hLa發(fā)揮結合作用的功能域。 2.體外轉錄研究表明：hLa上調HBV全基因和P基因的轉錄(P＜0.01)，對全C基因和X基因的轉錄分別出現(xiàn)顯著的促進和抑制作用；DeL2和DeL3對HBV全基因轉錄有較弱抑制作用(P值分別為0.017和0.03)；hLa及突變體在全S基因轉錄中未見顯著性作用，但下調了X基因轉錄，且DeL2的抑制作用最強。推測hLa的RRM3與X基因的轉錄調控有關。提示，hLa對HBV全基因及其ORF轉錄調節(jié)

17、的活性有差異，可能與各ORFRNA的不同空間結構相關。 3.體外翻譯實驗發(fā)現(xiàn)：hLa促進HBsAg表達、抑制HBeAg表達；DeL2和DeL3明顯促進HBeAg表達。表明DeL2和DeL3中缺失的肽段可能對C基因的體外表達有抑制作用。提示，hLa的不同部位或肽段對HBVRNA的調控效應不同。 4.在細胞水平上，探討La與HBV復制和蛋白表達的關系。結果表明：La特異性SiRNA降低了HepG2.2.15細胞中LamRNA

18、的表達；HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的含量隨LamRNA含量降低而減少。說明在HepG2.2.15細胞內，hLa與HBV的復制和蛋白表達有密切聯(lián)系。 5.本課題分別在體外轉錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達HBV肝癌細胞中，研究La對HBV轉錄、蛋白表達和病毒復制的影響。結果表明：hLa與HBVRNA有結合關系，hLa突變影響結合親和力，hLa和突變體的空間結構及HBVRNA的構象均不同程度影響HBV轉錄和翻譯，RRM3和RRM2都