1、大腸桿菌可引起人和動(dòng)物的腸內(nèi)腸外各種疾病，給畜牧養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。目前，對(duì)抗細(xì)菌病原主要依靠抗生素和宿主自身免疫系統(tǒng)?？股赝ㄟ^(guò)干擾細(xì)菌必要的合成代謝發(fā)揮殺菌抑菌作用，而宿主則通過(guò)免疫細(xì)胞和免疫分子發(fā)揮抗細(xì)菌感染作用。正因?yàn)榇?，?xì)菌進(jìn)化出抵御外界不良環(huán)境的能力，除了環(huán)境選擇使細(xì)菌獲得藥物降解、靶點(diǎn)突變或修飾的能力，細(xì)菌還會(huì)調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運(yùn)輸基因表達(dá)抵御抗生素?fù)p傷;而重要免疫因子過(guò)氧化氫刺激時(shí)，細(xì)菌上

2、調(diào)表達(dá)過(guò)氧化氫酶、谷還原酶、超氧化物歧化酶等以對(duì)抗氧化壓力，細(xì)菌的這一能力被稱為“壓力應(yīng)激”。實(shí)現(xiàn)壓力應(yīng)激調(diào)控需要將胞外信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜上受體傳遞至胞內(nèi)，改變RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境刺激。在細(xì)菌中，四（五）磷酸鳥(niǎo)苷酸ppGpp(p)和多聚磷酸polyP是細(xì)菌應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的重要信號(hào)分子。 ppGpp(p)由三磷酸鳥(niǎo)嘌呤焦磷酸合成酶RelA催化GTP焦磷酸化合成，該分子在氨基酸饑餓、碳營(yíng)養(yǎng)缺乏、紫外線照射、氧

3、化應(yīng)激和滲透壓等壓力應(yīng)激中均發(fā)揮重要作用。polyP由多聚磷酸激酶PPK以ATP和GTP為原料催化合成的高能磷酸多聚物，廣泛存在于微生物細(xì)胞中，在細(xì)菌中發(fā)揮多種功能，缺失PPK會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力下降、存活能力和運(yùn)動(dòng)能力降低、群體感應(yīng)和壓力應(yīng)激損傷。
　　鑒于polyP在壓力應(yīng)激方面的重要作用，本研究構(gòu)建了ppk缺失株△ppk，通過(guò)最小抑菌濃度測(cè)定、殺菌實(shí)驗(yàn)、基因表達(dá)檢測(cè)(RNA-seq和qRT-PCR)、生物膜形成分析等方法研究PPK

4、在腸外致病性大腸桿菌PCN033抗生素耐受中的作用;而polyp和ppGpp(p)在過(guò)氧化氫耐受中均發(fā)揮基因調(diào)控作用，因此本研究在缺失株△ppk基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙基因缺株△relA-△ppk和RelA缺失株△relA，通過(guò)最小抑菌濃度測(cè)定、抑菌實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR、western blot等方法研究PPK在腸外致病性大腸桿菌PCN033中的相互調(diào)控關(guān)系，得到以下結(jié)果:
　　1.浮游狀態(tài)下，缺失株△ppk較野生株對(duì)抗生素敏感
　　

5、依據(jù)抗生素作用靶點(diǎn)，將本研究所選用的抗生素分為四類:破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺類和糖肽類、干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類、干擾核酸合成的喹諾酮類和硝基呋喃類、破壞細(xì)胞膜的肽脂類。MIC分析顯示，缺失株△ppk較野生株對(duì)抗生素敏感，尤其是對(duì)具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁功能的β-內(nèi)酰胺類和干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類抗生素敏感?？股貧⒕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，浮游狀態(tài)下，缺失株△ppk更容易被抗生素殺死。上述結(jié)果表明PPK參與抗生素耐受。
　　2

6、.RNA-seq和qRT-PCR檢測(cè)缺失株△ppk的抗生素耐受相關(guān)基因的表達(dá)
　　對(duì)未經(jīng)抗生素處理的突變株△ppk和野生株WT進(jìn)行RNA-seq和qRT-PCR驗(yàn)證分析，結(jié)果顯示，16個(gè)抗性蛋白基因中僅tetB上調(diào)表達(dá);參與抗生素外排的35個(gè)基因中下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)閙arA、marB和mdtA;上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)閙dtG和madtE;參與抗生素胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因中僅ompC上調(diào)。無(wú)抗生素處理時(shí)，參與抗生素耐受的相關(guān)基因基因表達(dá)在野生株和突

7、變株中沒(méi)有顯著性變化。
　　對(duì)突變株△ppk和WT進(jìn)行他唑巴坦和慶大霉素處理，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。他唑巴坦處理會(huì)導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗性蛋白基因bla(ampC)上調(diào)，同時(shí)上調(diào)的基因還有aac，arnA，nfsA;慶大霉素處理對(duì)抗性蛋白基因的表達(dá)沒(méi)有影響，盡管突變株△ppk與WT之間外排基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。對(duì)隨機(jī)篩選的外排泵基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，他唑巴坦和慶大霉素處理均會(huì)使acrA、acrD、cu

8、sC、emrA、mdtA和marA顯著性上調(diào)，但突變株△ppk的上調(diào)倍數(shù)低于WT。他唑巴坦處理對(duì)水孔蛋白基因表達(dá)基本沒(méi)有影響，而慶大霉素處理則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)入基因ompC、ompF和phoE下調(diào)表達(dá)，但缺失株△ppk中下降的倍數(shù)顯著低于WT。在抗生素處理?xiàng)l件下，參與抗生素耐受的相關(guān)基因表達(dá)在WT和△ppk中具有顯著性差異，說(shuō)明PPK參與抗生素壓力應(yīng)激是通過(guò)接受刺激信號(hào)后調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運(yùn)輸基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　3.qRT-PCR

9、驗(yàn)證polyP對(duì)參與抗生素耐受的雙組分系統(tǒng)(TCSs)的激活情況
　　由于抗性蛋白基因bla(ampC)，胞內(nèi)運(yùn)輸基因ompC, ompF和外排泵基因acrA，acrF, acrD分別受到雙組分調(diào)控系統(tǒng)FimZ，OmpR和PhoB，CpxR，EvgA和TorR的調(diào)控。對(duì)參與抗生素耐受的雙組分調(diào)控系統(tǒng)FimZ，EvgA，OmpR，PhoB，BaeR，CpxR，TorR的下游基因ampC, emrKY, ompCF, phoA，tor

10、ACD，mdtAB和degP進(jìn)行RNA-seq和qRT-PCR驗(yàn)證。未經(jīng)抗生素時(shí)，與野生株相比，F(xiàn)imZ調(diào)控的抗性蛋白基因ampC沒(méi)有顯著性變化;BaeR調(diào)控的mdtA顯著性下調(diào)，其他雙組分調(diào)控的下游基因沒(méi)有顯著性變化;而OmpR調(diào)控的ompC和ompF表達(dá)顯著性上調(diào)。對(duì)WT和缺失株△ppk進(jìn)行慶大霉素處理，同時(shí)將敏感性未發(fā)生改變的諾氟沙星作為對(duì)照，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，諾氟沙星處理，與未處理野生株相比，僅有FimZ下游基因

11、ampC表達(dá)上調(diào)，而突變株△ppk內(nèi)表達(dá)未有顯著性變化。慶大霉素處理，與未處理野生株WT相比，TorR, BaeR，CpxR下游基因的表達(dá)均顯著性上調(diào)，且顯著性高于△ppk過(guò)表達(dá)polyP合成酶基因ppk會(huì)導(dǎo)致FimZ，EvgA，PhoB，TorR，BaeR和CpxR下游基因表達(dá)上調(diào)，而過(guò)表達(dá)polyP外切酶基因ppx則會(huì)導(dǎo)致這些雙組分下游基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明，polyP參與雙組分系統(tǒng)的激活與調(diào)控，并參與抗生素耐受。
　　4.P

12、PK參與生物膜形成且因而影響抗生素耐受
　　剛果紅染色實(shí)驗(yàn)表明，與生物膜形成相關(guān)的胞外多糖等物質(zhì)合成減少，表明△ppk缺失株生物膜形成受損?？股匚刺幚?xiàng)l件下，RNA-seq顯示突變株△ppk中參與生物膜形成的鞭毛基因、菌毛基因表達(dá)下調(diào);同時(shí)，他唑巴坦和慶大霉素處理?xiàng)l件下，盡管鞭毛和菌毛基因的表達(dá)趨勢(shì)不變，但參與生物膜形成的調(diào)控因子yddV、mcbR和bolA基因在WT中上調(diào)而突變株△ppk中下調(diào)，基因表達(dá)結(jié)果與缺失株△ppk生物

13、膜形成受損的表型較為符合，說(shuō)明PPK參與生物膜合成。MIC結(jié)果顯示，△ppk突變株的生物膜細(xì)胞與WT的生物膜細(xì)胞具有相同的抗生素敏感性。同時(shí)，抗生素清除突變株△ppk和WT生物膜的效率幾乎沒(méi)有差異。最后，抗生素殺菌實(shí)驗(yàn)表明，他唑巴坦和慶大霉素對(duì)△ppk突變株和WT突變株的生物膜細(xì)胞具有相同的殺菌效果。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，生物膜參與抗生素耐受，而PPK不影響細(xì)菌生物膜細(xì)胞狀態(tài)下的抗生素耐受。
　　5.PPK與RelA均參與過(guò)氧化氫耐受且均

14、影響細(xì)菌致病能力
　　MIC分析和過(guò)氧化氫殺菌實(shí)驗(yàn)表明，缺失株△ppk、缺失株△relA和雙缺失株△ppk-△relA相比于WT對(duì)過(guò)氧化氫的耐受程度下降。殺菌實(shí)驗(yàn)表明，PPK與RelA協(xié)同參與過(guò)氧化氫耐受。盡管過(guò)氧化氫處理不會(huì)導(dǎo)致WT內(nèi)polyP含量發(fā)生顯著性變化，但是在PPK過(guò)表達(dá)的菌株中，過(guò)氧化氫處理會(huì)導(dǎo)致polyP含量顯著性上升，polyP在此過(guò)程中發(fā)揮過(guò)氧化氫應(yīng)激調(diào)控功能。
　　對(duì)野生株、突變株△relA和△ppk進(jìn)

15、行倍比稀釋，將107、106劑量的細(xì)菌進(jìn)行昆明小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)，缺失株△ppk和△relA的小鼠死亡數(shù)目下降、存活時(shí)間延長(zhǎng)。細(xì)菌攻毒實(shí)驗(yàn)表明，PPK和RelA參與細(xì)菌致病過(guò)程。
　　6.PPK調(diào)控ppGpp(p)合成酶基因relA表達(dá)
　　qRT-PCR表明，缺失株△ppk內(nèi)relA表達(dá)輕微下調(diào)，在PPK過(guò)表達(dá)的菌株中，relA表達(dá)顯著性上調(diào);同時(shí)，Western Blot分析顯示過(guò)表達(dá)PPK會(huì)導(dǎo)致RelA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。在P

16、CN033中過(guò)表達(dá)大腸桿菌本身的PPX不會(huì)導(dǎo)致relA下調(diào)，但過(guò)表達(dá)釀酒酵母超強(qiáng)活性的PPX則會(huì)導(dǎo)致relA處于幾乎不表達(dá)的狀態(tài)。該結(jié)果表明，發(fā)揮relA基因表達(dá)調(diào)控功能的應(yīng)該為polyP分子而非PPK蛋白。說(shuō)明PPK在relA表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控功能。
　　7.relA基因上游調(diào)控序列TCSs結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)與TCSs蛋白表達(dá)
　　過(guò)表達(dá)TCSs反應(yīng)調(diào)控因子，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)多對(duì)雙組分系統(tǒng)參與調(diào)控relA基因的表達(dá)。

17、對(duì)relA基因上游1000bp的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，分別找出了雙組分反應(yīng)調(diào)控因子PhoB，OmpR, CpxR，DpiA，BasR，BaeR, TorR，ArcA可能的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建EnvZ-OmpR，PhoP-PhoB，CpxA-CpxR，TorS-TorR，BaeS-BaeR, EvgS-EvgA等12個(gè)蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以polyP為供體進(jìn)行體外磷酸化TCSs蛋白，并進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，確定TCSs在relA基因上游確定的結(jié)合位點(diǎn)。