1、大腸桿菌是寄居在哺乳動(dòng)物和禽類腸道中正常菌群之一，這一物種由非致病性菌株和具有不同致病潛能的致病菌株組成。少數(shù)致病性菌株，可引起機(jī)體腸道感染和腸道外感染兩大類疾病。致腸道外感染的大腸桿菌，如尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)，新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis-associated E.coli，NMEC)和敗血癥大腸桿菌(Sepsis-causing E.coli，SEP

2、EC)已被Johnson和Russo歸為一種新型致病性大腸桿菌—腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC）。另外，引起家禽局部或全身性感染的禽病原性大腸桿菌(Avian pathogenic E.coli，APEC)與引起人類感染的ExPEC(NMEC和UPEC)具有某些相似的致病因子，如1型菌毛、P菌毛、莢膜、鐵攝取系統(tǒng)、侵襲素IbeA等。有假設(shè)認(rèn)為禽可能是UPEC的主要攜帶

3、者，或者APEC可能是UPEC毒力基因的貯庫。
　　本研究主要通過探討莢膜、鐵攝取系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白R(shí)faH對(duì)APEC和UPEC致病性的影響，比較兩者毒力因子和致病機(jī)理的相似性，從而加深我們對(duì)APEC、UPEC毒力基因的形成、演化、致病機(jī)制的理解，強(qiáng)化我們對(duì)APEC作為UPEC毒力基因貯庫這一推斷的認(rèn)識(shí)，為深入研究尿道感染（Urinary tract infections，UTIs）和禽大腸桿菌病的致病機(jī)理和特異防制措施奠定基礎(chǔ)。

4、
　　1.鐵攝取系統(tǒng)對(duì)腸道外致病性大腸桿菌毒力的影響
　　APEC和UPEC都含有多種鐵攝取系統(tǒng)，包括血紅素和鐵結(jié)合性復(fù)合物。本研究以血紅素、沙門菌素和氣桿菌素三種鐵攝取系統(tǒng)為研究對(duì)象，分別選取其攝鐵相關(guān)基因chuT、iroD、iucD，運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建APEC E058和UPEC U17基因缺失株，進(jìn)行了多項(xiàng)體外及體內(nèi)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其致病性，旨在探究鐵攝取系統(tǒng)與APEC和UPEC致病性之間的關(guān)系，并比較兩者毒力因子之間

5、的相似性，為深入研究APEC和UPEC的致病機(jī)理和特異性防制措施奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，在SPF雞感染模型中，沙門菌素缺失株E058△iroD和U17△iroD與野生株相比，致病力顯著下降，氣桿菌素缺失株E058△iucD和U17△iucD在部分臟器中定植能力下降，而血紅素缺失株E058△chuT和U17△chuT未見致弱。三基因缺失株E058△chuT△iroD△iucD和U17△chuT△iroD△iucD致弱程度最為顯著。組織病理

6、學(xué)結(jié)果顯示，野生株感染雞的臟器病變程度較△iroD，△iucD及三基因缺失株感染情況更為嚴(yán)重，而△chuT缺失株感染雞的臟器病變程度與野生株相似。但是，體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株與野生株在抗血清補(bǔ)體殺菌、HD-11細(xì)胞吞噬和胞內(nèi)增殖，及在富鐵或缺鐵培養(yǎng)基中生長情況等方面都沒有顯著差異。SPF雞致病試驗(yàn)表明介導(dǎo)沙門菌素?cái)z鐵的iroD基因和編碼氣桿菌素合成的iucD基因與APEC和UPEC致病性有較強(qiáng)的相關(guān)性，而介導(dǎo)血紅素?cái)z鐵基因chuT對(duì)其

7、致病性影響不大。APEC和UPEC具有相似的攝鐵機(jī)制和致病能力，同時(shí)還可以看出沙門菌素鐵結(jié)合性復(fù)合物在雞體內(nèi)攝鐵方面起著更為重要的作用，但這些攝鐵系統(tǒng)之間的關(guān)系是相互獨(dú)立還是存在依賴關(guān)系還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。
　　2.調(diào)控蛋白R(shí)faH調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)情況及對(duì)腸道外致病性大腸桿菌毒力的影響
　　RfaH在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中是一種重要的調(diào)控蛋白，能夠增強(qiáng)某些細(xì)菌相關(guān)毒力因子的表達(dá)，如莢膜、脂多糖、溶血素、鐵攝取系統(tǒng)

8、等。它對(duì)于APEC毒力的直接影響至今還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)rfaH基因的缺失能顯著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。1日齡雛雞致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示rfaH基因突變株E058△rfaH和U17△rfaH對(duì)雞失去致病力，35日齡SPF雞體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布和競爭試驗(yàn)顯示△rfaH突變株在雞體內(nèi)定殖能力顯著下降;血清殺菌學(xué)試驗(yàn)表明突變株抗血清補(bǔ)體殺菌能力顯著下降;雞巨噬細(xì)胞HD-11吞噬和細(xì)菌胞內(nèi)定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株抗吞噬和胞內(nèi)生存

9、能力明顯致弱。對(duì)突變株進(jìn)行rfaH基因回復(fù)能夠使其恢復(fù)到野生株的毒力水平。同時(shí)，熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示rfaH基因缺失能顯著降低莢膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因kpsM和kpsE、血紅素受體基因chuA、抗血清補(bǔ)體相關(guān)基因traT和iss，及腸菌素ColicinV合成基因cvaC的表達(dá)量。上述結(jié)果表明，RfaH是腸道外致病性大腸桿菌的一種重要的毒力因子，對(duì)其致病性起著關(guān)鍵的作用。
　　3.腸道外致病性大腸桿菌莢膜缺失株的構(gòu)建及其致病性研究

10、r>　　莢膜在大腸桿菌抗血清補(bǔ)體和細(xì)胞吞噬方面發(fā)揮著重要的作用，利用λRed重組系統(tǒng)分別構(gòu)建APEC E058和UPEC U17莢膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因kpsED雙基因缺失株E058△kpsED和U17△kpsED，并成功將抗性基因去除，研究其生物學(xué)特性，為弱毒疫苗的開發(fā)提供條件。生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，kpsED雙基因缺失株的生長速度較野生株沒有明顯差異，但缺失株抗血清補(bǔ)體殺菌能力和抗雞巨噬細(xì)胞HD-11細(xì)胞吞噬能力顯著下降。kpsED雙基因的缺失能