1、本文主要就禽致病性大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查及三株大腸桿菌對磷霉素耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究，內(nèi)容如下： 1．禽致病性大腸桿菌的分離鑒定 從江蘇省及周邊城市的獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場，采集發(fā)生敗血性的病死禽的內(nèi)臟，無菌處理病料表面，采用常規(guī)三區(qū)劃線分離細(xì)菌。通過10項(xiàng)生化鑒定，最終得到195株APEC菌株。用標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌O血清型多因子血清及單因子血清，采用玻板和試管凝集試驗(yàn)，對所分離得到的菌株進(jìn)行O血清型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從禽體內(nèi)分離得到的菌株

2、的O血清型種類為53種，這已經(jīng)突破以往報道的禽體內(nèi)分離菌血清種類數(shù)。主要O血清型依次為078、088、09、093、024、0109、086，從不同地區(qū)分離得到的菌株的血清型種類和主要血清型有所不同、不同宿主來源的分離株的O血清型種類和優(yōu)勢血清型也存在一定的差異。078血清型在大部分地區(qū)的分離菌株中都是主要血清型，然而本次試驗(yàn)中，在廣西和揚(yáng)州分離株中，卻沒有發(fā)現(xiàn)078血清型的菌株。雞源菌株的主要血清型為078、O109、088、086，

3、鵝源菌株的主要血清型則為09，093二種血清型。此外，0114、0118、0123、0141、023、073等六種血清型也只出現(xiàn)于鵝源菌株，0143血清型只出現(xiàn)于鴨源菌株，0109等28種血清型只在雞源菌株中出現(xiàn)。只有011、0107三種血清型在三種家禽分離株中均出現(xiàn)。 2．禽致病性大腸桿菌藥物敏感性 根據(jù)目前臨床上治療大腸桿菌病的常用抗生素，選擇19種抗生素紙片，采用K-B圓紙片法，對以上分離所得的195株細(xì)菌的藥物敏

4、感性進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)規(guī)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，目前臨床上的APEC分離株耐藥現(xiàn)象已經(jīng)很嚴(yán)重，細(xì)菌的多重耐藥十分普遍，將近90％的分離菌株能抗8種以上抗生素。分離菌株對氟哌酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、壯觀霉素、四環(huán)素、鏈霉素、阿奇霉素、利福平等藥物的耐藥率均超過了70％。磷霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟等一些新特藥對目前的臨床分離菌株具有很好的抗菌治療效果，同時我們還發(fā)現(xiàn)多粘菌素

5、對APEC的抗菌效果最好，目前臨床分離菌暫時沒有耐多粘菌素的菌株發(fā)現(xiàn)。分離自不同地區(qū)的受試菌株對藥物的耐受情況不同，按一定的順序?qū)⒖股剡M(jìn)行排列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株的耐藥排列組合與其分離來源地存在一定的相關(guān)性，但與宿主來源沒有明顯的相關(guān)性。 3．禽致病性大腸桿菌毒力相關(guān)基因的分子流行病學(xué)調(diào)查研究 根據(jù)網(wǎng)上已經(jīng)公布的與禽致病性大腸桿菌致病過程中相關(guān)的基因的序列，參照有關(guān)文獻(xiàn)報道，分別設(shè)計特異性PCR擴(kuò)增引物13對，采用常規(guī)PCR

6、方法，獲得相應(yīng)的毒力基因，并進(jìn)行序列分析。將與標(biāo)準(zhǔn)序列同源性達(dá)到95％以上的菌株作為陽性對照菌株，建立PCR檢測方法，對195株APEC的13種毒力基因進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同基因的檢測率存在很大的差別。分屬于黏附系統(tǒng)和攝鐵系統(tǒng)的fimC和iucD基因的檢出率很高，分別達(dá)到93.8％、71.8％，說明黏附和鐵對APEC的致病性很重要。同處于HPI毒力島的結(jié)構(gòu)基因irp2和fyuA，在同一菌株中同時存在，陽性率為45.1％。相

7、比之下，papC，htyE基因的檢出率分別只有7.2％和4.1％。stx2f、 Vat、 astA、 coⅣ、Tsh和Iss基因的檢出率依次升高，分別為15.4％、26.2％、30.3％、34.9％、50.8％和60.0％。屬于LEE毒力島結(jié)構(gòu)基因的eae基因尚沒有檢出。 irp2和fyuA基因，在078血清型菌株中的陽性率高達(dá)94.7％，明顯高于其他優(yōu)勢血清型菌株。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在脅stx2f和vat兩個基因上，它們在O11

8、血清型菌株的陽性率(66.7％)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他血清型菌株同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，papC基因主要出現(xiàn)在O2、O24兩種血清型菌株中。將菌株攜帶毒力基因進(jìn)行統(tǒng)計后，發(fā)現(xiàn)有32個分離株共同擁有fimC-iucD-irp2-fyuA-iss-coⅣ-tsh基因組合模式，占總分離株的16.4％。優(yōu)勢血清型菌株所具有的毒力基因組合模式明顯要比非優(yōu)勢血清型菌株的少，說明毒力基因的組合模式與血清型具有一定的相關(guān)性。 4．野生大腸桿菌分離菌株對磷霉

9、素的耐藥機(jī)制 通過前面的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了三株耐磷霉素的野生大腸桿菌。這三株細(xì)菌對磷霉素的MIC值測定實(shí)驗(yàn)，表明其中兩株(JE1、CD11)對磷霉素極度抵抗，分別達(dá)到125000 μg/ml和51200μg/ml，另一株(IF7)屬于中度耐藥，為1280μg/ml。為了檢測耐藥菌細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)磷霉素的生物通道(glpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和Uhp系統(tǒng))的突變情況和攝取抗生素的能力，分別將耐藥菌接種在極限培養(yǎng)基中，測定其生長情況，并提取細(xì)菌的胞內(nèi)液

10、，檢測其中含有活性磷霉素的濃度。實(shí)驗(yàn)反映，IF7菌株的glpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)生了變化，對磷霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)效率下降，是導(dǎo)致其對磷霉素的中度耐藥的主要原因；細(xì)菌胞內(nèi)活性磷霉素濃度測定結(jié)果表明，CD11菌株對磷霉素的攝取能力很低，可能是導(dǎo)致其對磷霉素高度耐藥的機(jī)制之一，而IF7菌株的攝取能力因?yàn)間lpT系統(tǒng)的突變而變得相對較低。 針對磷霉素在細(xì)菌胞內(nèi)作用靶蛋白的編碼基因murA，設(shè)計特異性引物，運(yùn)用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得該基因，并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)

11、行序列比較分析，以鑒定該基因是否存在突變。以此同時，純化獲得的murA基因，將其插入到表達(dá)性載體pET32a，并轉(zhuǎn)入表達(dá)性宿主菌BL21a(DE3)中構(gòu)建重組菌，測定重組菌對磷霉素的MIC值，以說明存在的突變是否能引起對磷霉素的耐藥發(fā)生。murA基因序列比較分析結(jié)果顯示，CD11菌株在第116位氨基酸發(fā)生突變，并最終表現(xiàn)該基因的重組菌對磷霉素高度耐藥，這是其高度耐藥的又一原因。有趣的是，JE1菌株該基因在氨基酸水平上沒有發(fā)生變化，但由其

12、構(gòu)建的重組菌卻對磷霉素高度耐藥。提取耐藥菌的RNA，并進(jìn)行RT-PCR獲得cDNA，以cDNA為模板，以細(xì)菌的16sRNA為內(nèi)參照，采用SYBR Green熒光染料染色法，建立熒光定量PCR方法，對耐藥菌murA基因的表達(dá)水平差異情況進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株耐藥菌murA基因的表達(dá)水平都比陰性對照菌BL21要高。其中，JE1菌株該基因的表達(dá)水平最高，比IF7和CD11菌株的表達(dá)水平約高兩倍，比BL21菌株約高四倍，這可能就是該菌株的主要耐