1、禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽類(lèi)的心包炎、肝周炎、腹膜炎、敗血癥等,近年來(lái),該病腦膜炎型日益增多,出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的比例越來(lái)越多。APEC血清型多樣,其中O血清型176種,K型103種,H型83種,病原菌存在地區(qū)及品種差異；加之APEC耐藥性嚴(yán)重,難以完全控制或根除,給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。APEC不僅危害禽體健康,同時(shí)影響了產(chǎn)蛋量下降和肉用禽的上市時(shí)間,顯著增加飼養(yǎng)成

2、本,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的損失不容忽視,對(duì)食品安全構(gòu)成極大威脅。另外APEC也是一種人畜共患病病原體,因此對(duì)該病原的研究在養(yǎng)禽業(yè)和人類(lèi)公共衛(wèi)生上均有重大意義。
　　 針對(duì)大腸桿菌的致病機(jī)理已經(jīng)有比較多的研究,但是還有許多致病機(jī)理尚不明晰,為了進(jìn)一步深入了解禽致病性大腸桿菌的致病機(jī)理,本試驗(yàn)采用抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的方法對(duì)禽致病性大腸桿菌IMT5155菌株和人

3、尿源性大腸桿菌 CFT073差異基因序列進(jìn)行了研究,并通過(guò)Southern blot方法進(jìn)行了篩選,通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了28個(gè)可能的新毒力基因片段,并對(duì)這些基因在國(guó)內(nèi)外不同致病型大腸桿菌中的分布進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。然后通過(guò)對(duì)新的疑似毒力基因的進(jìn)一步克隆表達(dá)分析其免疫原性,為亞單位疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。
　　 為了獲得禽致病性大腸桿菌IMT5155新的毒力基因,采用抑制性差減雜交的方法將禽致病性大腸桿菌IMT5155和人尿源性大腸桿菌

4、CFT073進(jìn)行差減分析。首先,提取兩株細(xì)菌基因組DNA,RsaI酶切回收。酶切的IMT5155(Tester)基因組分別連接兩個(gè)不同的接頭,經(jīng)過(guò)兩輪雜交后,PCR擴(kuò)增IMT5155特有基因序列,擴(kuò)增產(chǎn)物連接TOPO TA載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化克隆,PCR分析其中96個(gè)為陽(yáng)性克隆。這些陽(yáng)性克隆經(jīng)Southern blot進(jìn)一步分析,將96個(gè)陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物變性固定于尼龍膜,分別與地高辛標(biāo)記的CFT073及無(wú)毒大腸桿菌MG1655

5、酶切基因組DNA雜交。雜交無(wú)條帶者即為陽(yáng)性克隆,結(jié)果獲得了34個(gè)IMT5155特異目的基因片段。然后將獲得的基因片段進(jìn)行測(cè)序并上傳 NCBI,經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)這些片段編碼了多種蛋白,如唾液酸酶及唾液酸合成相關(guān)蛋白、DNA轉(zhuǎn)移蛋白、EntS/YbdA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白、自分泌黏附素、Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶以及一些未知功能的蛋白等,根據(jù)比對(duì)結(jié)果可知一些蛋白在大腸桿菌的致病過(guò)程中起著重要的作用。這一發(fā)現(xiàn)將有助于開(kāi)展禽致病性大腸桿菌新

6、的毒力基因的致病機(jī)理研究。
　　 通過(guò)對(duì)所獲得的28個(gè)疑似毒力基因的分析,選擇了自分泌黏附素、唾液酸酶及唾液酸合成相關(guān)蛋白、DNA轉(zhuǎn)移蛋白、EntS/YbdA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白和糖基轉(zhuǎn)移酶等12個(gè)具有代表性的疑似毒力基因片段設(shè)計(jì)引物,采用PCR和 Dot blot方法檢測(cè)這些疑似毒力片段在222株不同來(lái)源大腸桿菌中的分布。結(jié)果表明,SSH篩選到的疑似毒力基因在禽致病性大腸桿菌中廣泛分布,在豬源大腸桿菌中極少分布。值得注意的是疑似毒

7、力基因片段D1、E9和F11在新生兒腦膜炎大腸桿菌中分布率較高,暗示這些基因在新生兒腦膜炎的致病過(guò)程中可能存在相關(guān)性。B11片段在APEC中分布率較高,為進(jìn)一步研究該片段所在的基因功能提供了線(xiàn)索。
　　 根據(jù)NCBI BLAST比對(duì)及F11片段的測(cè)序結(jié)果,分析F11片段所在的ORF編碼的氨基酸特性,去除跨膜區(qū),設(shè)計(jì)表達(dá)引物,將F11片段克隆連接至表達(dá)載體pET-28a(+)中,重組質(zhì)粒通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序正確后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)