1、禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)是養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，至今尚無有效的防治措施。禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic E.coli,APEC)分離株眾多，其詳細(xì)致病機(jī)理還有待深入研究，但是已經(jīng)證實(shí)眾多的毒力基因是其主要致病因子。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥ secretion system，T6SS）是一種新型分泌系統(tǒng)，Hcp管道是其主要結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌致病過程中扮演重要角色

2、。本研究以Hcp主要亞單位hcp1和hcp2基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，探討其在APEC CE129菌株感染宿主過程中的病原性。
　　試驗(yàn)通過比對(duì)NCBI上hcp1、hcp2基因的已知序列，利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對(duì)禽致病性大腸桿菌(APEC)野生株CE129的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS) hcp1和hcp2基因進(jìn)行敲除。首先各設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株APEC CE129是否含有hcp1和hcp2基因，引物分別與GeneBank中已知的h

3、cp1和hcp2基因序列5'端同源。然后根據(jù)試驗(yàn)菌株的hcp1和hcp2基因再各設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其5'端分別與hcp1和hcp2基因序列兩側(cè)同源，而3'端則與質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性基因Cat同源，用于獲得帶氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，純化后導(dǎo)入含有質(zhì)粒pKD46的APEC CE129菌株中，在Red重組酶Beta、Exo、Gam作用下，氯霉素抗性基因片段依靠兩側(cè)同源序列與細(xì)菌染色體的靶基因發(fā)生重組，將hcp1和hcp2基因置換下來，通過

4、氯霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆，即完成一次重組。再電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過對(duì)Cat兩側(cè)Flp位點(diǎn)的識(shí)別，消除抗性基因，即完成二次重組。最后通過PCR特異性檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果，驗(yàn)證缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和CE129△hcp1△hcp2的成功構(gòu)建。體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果表明，△hcp1缺失株在與野生株的競(jìng)爭(zhēng)中處于微弱劣勢(shì)，其毒力被輕度弱化。血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，相比野生株CE129，缺失株CE129△

5、hcp1、CE129△hcp2、 CE129△hcp1△hcp2抵抗血清補(bǔ)體殺菌的能力分別下降32.7％、35.1％和50.6％(p＜0.01)。生物膜定性定量試驗(yàn)結(jié)果表明，△hcp2缺失株形成生物膜能力下降40％(p＜0.01)，回補(bǔ)株上升至87％。DF1細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，△hcp2缺失株的黏附能力下降46％(p＜0.01)，回補(bǔ)株上升至96％。雞胚體內(nèi)感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，△hcp1和△hcp2單缺失株在雞胚體內(nèi)的增殖水平約為野生株

6、的1/3，△hcp1△hcp2雙缺失株約為野生株的1/2。Real Time PCR定量試驗(yàn)結(jié)果顯示，hcp1和hcp2基因具有協(xié)同表達(dá)關(guān)系;相比野生株CE129，缺失株CE129△hcp1對(duì)群體感應(yīng)luxS、lsrR、pfs基因表達(dá)量分別下降29％、41％、33％(p＜0.05)，hcp1回補(bǔ)株分別上升至85％、98％、96％，對(duì)抗血清存活因子ompA和iss基因表達(dá)量分別下調(diào)29％和24％(p＜0.05)，回補(bǔ)株分別上升至109％和

7、105％;缺失株CE129△hcp2對(duì)菌毛fimA基因表達(dá)量下調(diào)47％(p＜0.01)，hcp2回補(bǔ)株上升至88％，對(duì)黏附相關(guān)基因fimC和papC基因表達(dá)量分別下降60％和37％(p＜0.01)，回補(bǔ)株分別上升至84％和96％，對(duì)抗血清存活因子ompA和iss基因表達(dá)量分別下調(diào)31％和41％(p＜0.05)，回補(bǔ)株分別上升至109％和88％。綜上所述，CE129的hcp2基因在細(xì)菌黏附，生物膜形成和血清殺菌過程中扮演重要角色，而hcp