1、前言：卵巢癌的病死率在婦科惡性腫瘤中居首位,目前其發(fā)生機理尚不清楚。近年來,糖復合物與腫瘤的關系受到廣泛關注。糖復合物是細胞膜的重要組成部分,參與信號轉導、分子粘附等作用,與細胞生長、凋亡、運動、分化等生命過程密切相關。細胞癌變后細胞膜上的糖復合物,特別是其糖鏈部分發(fā)生結構和量的變化。卵巢癌主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的改變,如Lewisy抗原。研究表明75％的上皮性卵巢癌出現(xiàn)Lewisy不同程度的過量表達,且增高的患者預后不良。
　　

2、Lewis抗原是腫瘤相關抗原,腫瘤標記物CA125和MUC-1的分子結構中均含有Lewisy結構。Lewis抗原是細胞表面糖脂或糖蛋白上的糖類抗原,其最小組成單位是三糖,即半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和巖藻糖(Fuc),它們連接成Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(即Lewis a)或Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(即Lewis x)。如上述兩種Lewis抗原中半乳糖的外側再接上另一個Fu

3、ca1,2,即分別為Lewis b或Lewisy。Lewis抗原合成的關鍵酶是巖藻糖轉移酶(fucosyltransferase,FucT),催化GDP-Fuc的Fuc轉移至糖鏈中N-乙酰氨基乳糖殘基的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)上,并以α巖藻糖鍵相連接,其底物主要是糖蛋白的O-糖鏈、N-糖鏈、乳糖系或新乳糖系的糖脂。α巖藻糖轉移酶家族目前發(fā)現(xiàn)有9型,其中α1,2-巖藻糖轉移酶是合成Lewisy抗原的關鍵限速酶。
　　 我

4、們在前期工作中利用基因轉染技術將人α1,2-巖藻糖轉移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因轉入卵巢癌細胞系RMG-1,建立了Lewisy穩(wěn)定高表達卵巢癌細胞系RMG-1-hFUT,發(fā)現(xiàn)基因轉染后RMG-1-hFUT細胞惡性行為增強。我們推測Lewisy可能作為粘附分子的重要結構參與細胞內信號轉導,進而影響卵巢癌細胞的生物學行為。本研究在前期工作的基礎上,利用已經建立的Lewisy穩(wěn)定高表達細胞,探討L

5、ewisy與整合素α5β1的結構關系,及對其介導的卵巢癌細胞粘附、轉移和耐藥的影響,為研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制奠定基礎,為卵巢癌的早期診斷及靶器官治療提供理論依據。
　　 方法：
　　 論文一:免疫細胞化學染色法檢測基因轉染前后細胞中Lewisy抗原和整合素α5/β1的表達,并采用抗體進行阻斷,再檢測其表達的變化;免疫沉淀檢測Lewisy與整合素α5/β1的關系。
　　 論文二:倒置顯微鏡觀察細胞在FN上的形態(tài)及

6、鋪展情況;Busk方法測定細胞粘附能力;劃痕實驗檢測細胞遷移能力;細胞體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;ELISA、Western blot和實時RT-PCR方法檢測基因轉染前后細胞中TIMP-1、TIMP-2,MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達;采用抗體阻斷后再檢測各組細胞粘附轉移情況。
　　 論文三:建立FN介導的細胞粘附模型;MTT檢測細胞生長情況;FCM、熒光染色法和透射電鏡檢測各組細胞凋亡情況;免疫細胞化學、Wes

7、tern blot和實時PCR檢測各組細胞Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK蛋白和基因的表達。采用不同抗體或抑制劑處理各組細胞再檢測細胞凋亡和相關分子表達情況。
　　 結果：
　　 論文一:RMG-1-hFUT細胞中Lewisy抗原、整合素α5/β1的表達較RMG-1細胞增高,抗整合素α5、β1抗體阻斷后,Lewisy表達下降;抗Lewisy抗體阻斷后,整合素α5和β1的表達下降。免疫沉淀結果顯示整合素α5和β

8、1上有Lewisy,且RMG-1-hFUT中整合素α5和β1上總Lewisy的表達均較RMG-1增高。
　　 論文二:RMG-1-hFUT細胞鋪展、粘附和轉移能力明顯高于RMG-1,抗Lewisy抗體處理后下降。RMG-1-hFUT細胞TIMP-1和TIMP-2在基因和蛋白水平的表達均較RMG-1低,而MMP-2和MMP-9的表達增高,抗Lewisy抗體阻斷后,TIMP-1/2蛋白表達升高,而MMP-2/9下降。
　　

9、論文三:各組細胞的生長抑制率隨著卡鉑濃度的增加而升高,IC50由低到高依次為RMG-1組、FN-RMG-1組、RMG-1-hFUT組、FN-RMG-1-hFUT組。不同抗體或抑制劑處理后,各組IC50不同程度下降,其中抗Lewisy抗體最明顯。卡鉑處理前,RMG-1-hFUT組中Bc1-2的表達較RMG-1組低、Bcl-XL和p-FAK較RMG-1組高、FAK無明顯差異;與FN粘附后,Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表達均增

10、高,且FN-RMG-1-hFUT組高于FN-RMG-1組?？ㄣK處理后,各組Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表達進一步增強,抗Lewisy抗體阻斷后,其表達下降。
　　 結論：
　　 論文一:Lewisy是整合素α5β1結構的一部分,α1,2-FT基因轉染使細胞整合素α5β1表達增加,且整合素α5β1亞基上Lewisy的表達也增加。
　　 論文二:Lewisy結構增加整合素α5β1介導的細胞粘附、侵襲及