羅伯茨綠僵菌類膠原蛋白基因(Mcl2)的功能研究.pdf_第1頁(yè)
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1、昆蟲(chóng)病原真菌廣泛用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治,由于其環(huán)境安全性、強(qiáng)致病性以及潛在的流行性,成為很有應(yīng)用潛力的生物制劑。羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robberstii)作為一種昆蟲(chóng)病原菌的模式生物,一直在昆蟲(chóng)病原真菌的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制、致病機(jī)制及生物防治方面的研究中走在前列。類膠原蛋白(collagen-like protein)基因存在于病毒、細(xì)菌和真核生物內(nèi),在調(diào)控生物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝途徑和致病性等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明

2、,分析熱激處理的綠僵菌孢子轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜,在所有上調(diào)的基因中,一種類膠原蛋白的基因表達(dá)上調(diào)幅度位居前三,我們推測(cè)類膠原蛋白可能在綠僵菌的抗逆過(guò)程起著較為重要的作用。為此,本文對(duì)羅伯茨綠僵菌內(nèi)類膠原蛋白基因(Mcl2)的功能進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,意在闡明Mcl2的遺傳信息,并明確該基因在抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育以及殺蟲(chóng)能力等方面的作用,為人工創(chuàng)制高效殺蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因綠僵菌菌株提供新基因儲(chǔ)備。
  本研究首先對(duì)綠僵菌類膠原蛋白基因克隆注釋,獲得Mcl2

3、遺傳信息;其次利用同源重組的原理,運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得該基因的敲除菌株及回補(bǔ)菌株。最后,通過(guò)對(duì)野生型菌株、敲除突變體菌株和回補(bǔ)突變體菌株表型的分析,獲得Mcl2功能特征。具體的研究結(jié)果如下:
  (1)通過(guò)RACE克隆與測(cè)序方法,得到了Mcl2的cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息注釋,而且通過(guò)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),表明本研究的這種羅伯茨綠僵菌基因(Mcl2)可能是一種新

4、的類膠原蛋白基因。
  (2)通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pDHt-SK-Mcl2L-BAR-Mcl2R和pDHt-SK-Mcl2-BEN,再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和同源重組基因敲除的方法,最后成功得到?Mcl2(敲除突變體)和?Mcl2/Mcl2(回補(bǔ)突變體)。
  (3)比較WT(野生型菌株)、?Mcl2(敲除突變體)和?Mcl2/Mcl2(回補(bǔ)突變體)之間的生物學(xué)性狀表明:在PPDA、PDA、SDAY和1/4SDAY培養(yǎng)基上,敲除突變體的

5、菌落顏色和形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度與野生型菌株相比均無(wú)顯著差異;而SDAY、1/4SDAY、PPDA及PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量略低于野生型菌株,分別為下降了8.34%、9.27%、8.45%和9.89%,?Mcl2/Mcl2與WT的產(chǎn)孢量基本一致。
  (4)對(duì)上述3個(gè)菌株的逆境脅迫分析表明:它們的分生孢子38°C熱激處理2 h,發(fā)現(xiàn)敲除Mcl2后,其分生孢子的萌發(fā)率降為40.19%,與野生型菌株相比降低了34.79%,表明缺失Mcl2的菌

6、株對(duì)外界溫度的變化更敏感。而對(duì)分生孢子紫外照射3 min,敲除菌株分生孢子萌發(fā)率為56.48%,較野生型菌株和回補(bǔ)菌株分別減少9.45%和9.10%,并沒(méi)有明顯變化。在化學(xué)試劑脅迫研究中發(fā)現(xiàn),在加入多菌靈、H2O2、SDS、Congo Red等不同化學(xué)物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基中,敲除突變體的生長(zhǎng)狀況與野生型亦無(wú)明顯差異。
  (5)用這3種不同菌株的分生孢子(107 conidia/mL)侵染大蠟螟,與野生型綠僵菌相比,敲除了Mcl2的

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