1、[研究背景]共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒(HBV)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程的初始模板,也是病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成的第一個(gè)復(fù)制中間體,它的形成標(biāo)志著病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)感染狀態(tài)的建立和復(fù)制循環(huán)的開(kāi)始。HBV cccDNA在肝細(xì)胞核內(nèi)形成含量相對(duì)穩(wěn)定的池,目前絕大多數(shù)臨床上應(yīng)用的抗HBV藥物均難以清除細(xì)胞內(nèi)的cccDNA,被認(rèn)為是抗病毒治療后乙型肝炎復(fù)發(fā)的重要原因。HBV cccDNA的檢測(cè)對(duì)抗HBV藥物的研發(fā)和應(yīng)用評(píng)價(jià),以及慢性乙

2、型肝炎(CHB)患者的病情監(jiān)測(cè)和抗病毒療效評(píng)估等具有十分重要的臨床意義。就現(xiàn)有抗HBV藥物的療效看來(lái),尚無(wú)能夠迅速抑制或是清除被感染肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的治療藥物或方案,針對(duì)HBVcccDNA的藥物研發(fā)和療效監(jiān)測(cè)工作尚未取得明顯進(jìn)展。本研究以我們實(shí)驗(yàn)室前期建立的一套特異、靈敏的HBV cccDNA檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ),在HepG2.2.15細(xì)胞平臺(tái)上對(duì)胡黃連苷促進(jìn)清除HBV cccDNA的作用效果和特點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比評(píng)估,并試圖對(duì)相關(guān)機(jī)制

3、作出初步探討。 本研究共分為三個(gè)部分：(一)胡黃連苷促進(jìn)清除HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的作用效果和特點(diǎn)研究。以阿德福韋酯為對(duì)照,分別觀察胡黃連苷和阿德福韋酯作用后HepG2.2.1 5細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量變化,定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBVDNA、cccDNA和pgRNA水平并計(jì)算相應(yīng)抑制率,比較胡黃連苷與阿德福韋酯作用的不同效果和特點(diǎn)。(二)胡黃連苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋分布

4、的影響。采用專門的二維凝膠電泳方法觀察胡黃連苷作用前后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布有無(wú)變化,并與阿德福韋酯作用結(jié)果相對(duì)比,利用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,探尋胡黃連苷對(duì)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布的影響。(三)胡黃連苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)OAS1、STAT2、ISGF3γ、MyD88、MxA等候選基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。對(duì)于胡黃連苷作用后有明顯差異轉(zhuǎn)錄的基因再以siRNA技術(shù)選擇性沉默阻斷,

5、以反向驗(yàn)證相關(guān)基因參與胡黃連苷抗HBV作用的可能性。 第一部分：胡黃連苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA含量的影響 目的:觀察胡黃連苷抑制HepG 2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的作用效果及特點(diǎn)。 方法:分別用含胡黃連苷50μg/ml、胡黃連苷100μg/ml或阿德福韋酯5μg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液作用于HepG2.2.15細(xì)胞,加藥后2d、5d收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢

6、測(cè)上清和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA和pgRNA水平,分別計(jì)算抑制率。 結(jié)果:①胡黃連苷50μg/ml作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為49.74％和79.48％；細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率43.55％和 56.43％,rcDNA抑制率43.39％和63.86％,pgRNA抑制率54.72％和56.08％。②胡黃連苷100μg/ml作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為51.11

7、％和82.07％；細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA抑制率41.13％和57.59％,rcDNA抑制率45.09％和67.31％,pgRNA抑制率52.68％和52.47％。③阿德福韋酯作用后2d和5d,上清HBV DNA抑制率分別為25.56％和92.44％；細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率18.54％和47.19％,rcDNA抑制率21.20％和71.47％,pgRNA抑制率11.14％和37.61％。 結(jié)論:胡黃連苷能夠明顯抑制He

8、pG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制水平,對(duì)HBV cccDNA也具有抑制作用,而且在作用時(shí)相上早于阿德福韋酯,可能存在不同的作用機(jī)制。 第二部分:胡黃連苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋分布的影響 目的:觀察HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量分布規(guī)律及胡黃連苷、阿德福韋酯對(duì)其影響。 方法:實(shí)驗(yàn)共分3組,分別用含胡黃連苷50μg/ml、阿德福韋酯5μg/ml和空白細(xì)胞培養(yǎng)液

9、作用于HepG2.2.15細(xì)胞,加藥后2d、5d收集細(xì)胞,提取細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA,經(jīng)二維凝膠電泳分離含有不同超螺旋數(shù)量的cccDNA,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜與32P-dCTP標(biāo)記的HBV DNA探針雜交、放射顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描A(0～5個(gè)超螺旋)、B(6～10個(gè)超螺旋)、C(11～15個(gè)超螺旋)、D(16～20個(gè)超螺旋)區(qū)域條帶灰度值,計(jì)算各區(qū)域灰度積分值所占構(gòu)成比,用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法分析組間差異。 結(jié)果:①用藥2d時(shí)胡

10、黃連苷組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 14.94％、B 33.32％、C 35.96％、D 14.05％,阿德福韋酯組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.00％、B20.04％、C 25.55％、D 39.04％,空白對(duì)照組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 12.36％、B21.04％、C 23.22％、D 40.77％。其中胡黃連苷組分別與空白對(duì)照組和阿德福韋酯組cccDNA超螺旋分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Nemenyi檢驗(yàn),χ21,3=12.86,X21,2=8.28

11、,P<0.01),而阿德福韋酯組與空白對(duì)照組cccDNA超螺旋分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ22,3=2.58,P>0.25)。②用藥5d時(shí)胡黃連苷組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 15.40％、B 33.48％、C 34.47％、D 15.07％,阿德福韋酯組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.30％、B 20.52％、C 23.22％、D 42.12％,空白對(duì)照組各區(qū)構(gòu)成比中位值為A 13.02％、B 21.24％、C 22.91％、D40.61％。其中胡

12、黃連苷組分別空白對(duì)照組和阿德福韋酯組cccDNA超螺旋分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Nemenyi檢驗(yàn),χ21,3=11.61,χ21,2=9.58,P<0.01),阿德福韋酯組與空白對(duì)照組cccDNA超螺旋分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ22,3=0.86,P>0.75)。③空白對(duì)照組HepG2.2.1 5細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA分子所含超螺旋數(shù)量分布并不均勻,以D區(qū)所占比例最多(約40％),B區(qū)和C區(qū)次之(各約20％),A區(qū)最少,2d和5d間數(shù)據(jù)分布

13、差異沒(méi)有顯著性(Mann-Whitney U檢驗(yàn),U=0.321,P=0.748)。 結(jié)論:HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA超螺旋數(shù)量呈現(xiàn)相對(duì)固定的異質(zhì)性分布狀態(tài),阿德福韋酯處理2d和5d均未改變分布規(guī)律；胡黃連苷能夠減少HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA內(nèi)部超螺旋數(shù)量,可能導(dǎo)致cccDNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的減低,促進(jìn)HBV cccDNA的清除。 第三部分:胡黃連苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分基因

14、轉(zhuǎn)錄水平的影響 目的:觀察胡黃連苷能否影響HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分候選基因的轉(zhuǎn)錄,探討其與抗HBV效應(yīng)的關(guān)系。 方法:①選取既往報(bào)道的能夠促進(jìn)感染細(xì)胞內(nèi)HBV pgRNA降解的部分基因如2',5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子2(STAT2)、干擾素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、髓樣細(xì)胞分化蛋白(MyD88)和MxA蛋白作為候選基因,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)胡黃連苷作用后48h

15、HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)OAS1、STAT2、ISGF3γ、MyD88和MxA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平變化,以β-actin基因mRNA作為檢測(cè)內(nèi)參照。②用MyD88 siRNA誘導(dǎo)沉默HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MyD88基因轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)胡黃連苷作用下HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MyD88 mRNA、HBV pgRNA及培養(yǎng)上清中HBV DNA水平變化。③用MyD88siRNA誘導(dǎo)沉默HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MyD

16、88基因轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)胡黃連苷作用下HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MyD88 mRNA、HBV cccDNA水平變化,二維電泳方法觀察cccDNA超螺旋分布情況并作組間比較。 結(jié)論:胡黃連苷作用可以誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MyD88基因活躍轉(zhuǎn)錄,并通過(guò)MyD88途徑促進(jìn)HBV pgRNA的降解。但是MyD88并未參與胡黃連苷早期抑制HBV cccDNA的過(guò)程,胡黃連苷體外抑制HBV cccDNA、減少HepG