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文檔簡介
1、目的:冠心病是最常見的心血管疾病之一,是一種嚴重危害人類健康的疾病,其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來,感染、炎癥與冠心病的關系成為研究的熱點。本實驗的目的在于檢測冠心病患者與健康對照者MBL基因Exon I54位密碼子點突變情況,同時測定血漿中MBL與CRP含量及肺炎衣原體感染情況,旨在通過分析這些因素的變化及相關性,探討冠心病的可能致病機制,為其輔助診斷和治療提供依據(jù)。 方法: 1 標本的收集與處理取100例冠心病
2、(CHD)病人和60例健康對照人抗凝血,2小時內(nèi)分離血漿與細胞成分,血漿于-80℃保存,供測定MBL含量、CRP及肺炎衣原體;用鹽酸胍法提取血細胞中DNA,-80℃冰凍保存,供MBL基因突變檢測。 2 測試標本 (1)用PCR-RFLP法測試MBL Exon I 54位密碼子基因點突變:擴增體系為50μl,其中10×Buffer 5μl,dNTP(2.5mmol/L)4μl,primerl(50μmol/L)0.4μl,
3、primer2(50μmol/L)0.4μl,TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.5μl,模板4μl,滅菌三蒸水補至50μl。擴增參數(shù)為:預變性95℃5分鐘;95℃45秒、55℃45秒,72℃1分鐘,循環(huán)30次; 末延伸72℃ 5分鐘。擴增產(chǎn)物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙啶2%的瓊脂糖凝膠電泳,加樣5μl/孔,電泳30分鐘;PCR Marker作為參照,對擴增產(chǎn)物進行分析。對擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶(Bsh N1)酶切:酶
4、切體系為20μl,其中:Bsh N1(10u/μl)0.5 μl,10×Buffer 2μl,DNA擴增產(chǎn)物17.5μl,37℃水浴反應1小時,酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)酶切結果,針對性的選擇部分完全切割、不完全切割和未切割的PCR擴增產(chǎn)物測序,進行序列分析比對。 (2)血漿MBL含量測定:按MBL ELISA試劑盒說明書。 (3)用肺炎衣原體IgG ELISA試劑盒測定衣原體感染情況。 (4)免疫比濁法測
5、定Hs-CRP含量,在全自動生化分析儀上進行。 結果: 1 冠心病組、健康對照組MBL基因Exon 154位密碼子點突變頻率100例冠心病人MBL基因ExonI 54位密碼子點突變情況,在所檢測到的100例中,野生型(GGC/GGC)為73例,占73%;突變雜合子型(GGC/GAC)為25例,占25%;突變純合子型(GAC/GAC)為2例,占2%。基因頻率分別為GGC為85.5%,GAC為14.5%。 60例健康
6、對照組MBL基因ExonI 54位密碼子點突變情況,在所檢測到的60例中,野生型(GGC/GGC)為45例,占75%;突變雜合子型(GGC/GAC)為13例,占27.67%;突變純合子型(GAC/GAC)為2例,占3.32%?;蝾l率分別為GGC為85.8%,GAC為14.2%。經(jīng)x<'2>檢驗,x<'2>=0.007,p=0.934,冠心病組、健康對照組基因點突變頻率的比較差別無統(tǒng)計學意義。 2 血漿MBL含量測定100例冠心
7、病人血漿MBL含量的平均值為3900μg/L,標準差為3209;60例健康對照組血漿MBL含量的平均值為2056μg/L,標準差為1824。冠心病組血漿MBL含量高于健康對照組,差別有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。 3 冠心病組、健康對照組抗肺炎衣原體抗體(CP IgG)的測定100例冠心病人血漿CP IgG陽性51例,占51.00%;60例健康對照組血漿CP IgG陽性20例,占33.33%,二者有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。
8、 4 冠心病組與健康對照組血漿中CRP含量比較分析100例冠心病人血漿CRP含量的平均值為10.257 mg/L,標準差為12.216;60例健康對照組血漿CRP含量的平均值為1.488 mg/L,標準差為1.558,二者比較差別有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。 5 冠心病人CP IgG陽性和陰性組血漿MBL含量的比較按CP IgG陽性和陰性將冠心病人分為兩組,CP IgG陽性組和陰性組的血漿MBL均值(±SD)分別為3
9、819(±3090)μZ/L和3985(±3359)μg/L,經(jīng)t檢驗二者無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。 6 冠心病人CP IgG陽性和陰性組血漿CRP含量的比較按CP IgG陽性和陰性將冠心病人分為兩組,CP IgG陽性組和陰性組的血漿CRP均值(±SD)分別為10.439(± 13.451)mg/L和10.068(±10.921)mg/L,經(jīng)t檢驗二者無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。 7 冠心病組血漿中CRP與MBL含
10、量比較及相關性分析按CRP水平升高(>3mg/L)與否將冠心病人分為兩組,CRP水平升高組和CRP水平正常組的血漿MBL均值(±SD)分別為3723(±2783)μg/L和4258(±3961)μg/L,經(jīng)t檢驗二者無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。 在100例冠心病樣本中,CRP與MBL含量使用Pearson相關性分析,r=0.144,p=0.245,沒有發(fā)現(xiàn)二者有相關關系。 結論: 本研究對中國北方漢族冠心病患者
11、和健康對照的MBL基因54位密碼子點突變,MBL,CPIgG和CRP進行了檢測。發(fā)現(xiàn)以下3點: 1 MBL基因54位密碼子點突變在冠心病組、健康對照組分別為14.5%和14.2%,無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 2 血漿MBL,CRP均值(±SD)在冠心病組分別為3900(±3209)μg/L和10.26(±12.22)mg/L,在健康對照組分別為2056(±1824)μg/L和1.49(±1.56)mg/L。這兩項指標
12、在冠心病組較健康對照組均顯著升高,差別有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。 MBL與CRP屬于炎癥急性期蛋白,這兩項指標在冠心病組較健康對照組均顯著升高,提示該兩項指標在冠心病診斷和發(fā)生機理中的作用應該進一步研究。雖然MBL和CRP在冠心病人顯著升高,但是這兩項指標之間不顯示相關,提示它們可能以不同機理參與冠心病發(fā)生。 3 冠心病組血漿CP IgG陽性率為51.00%,健康對照組為33.33%,CP IgG在冠心病人中的陽
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