1、肝纖維化(Hepatic Fibrosis)是肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝內(nèi)纖維及成纖維結(jié)締組織增生的病理過程，是慢性肝病可逆轉(zhuǎn)的重要病理階段，也是發(fā)展為肝硬化形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。肝星狀細(xì)胞(H S C)是位于D i s s e間隙的一種間質(zhì)細(xì)胞。肝損傷后期表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，可大量增殖并產(chǎn)生各種細(xì)胞外基質(zhì)，并可通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，故在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。臨床上以肝臟活檢為診斷肝纖維化的最可靠方法。

2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究以血清學(xué)四項(xiàng)指標(biāo)和病理學(xué)檢測(cè)居多。我國肝病發(fā)病率極高，據(jù)保守估計(jì)各類肝炎病毒攜帶者及患者超過一億，對(duì)肝纖維化可逆轉(zhuǎn)階段的藥物干預(yù)研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 目的： 丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液目前臨床用于心血管病的治療，因其療效確切，該藥的社會(huì)需求將會(huì)逐漸增加。此藥的生產(chǎn)工藝也已經(jīng)很成熟，并且丹參已實(shí)現(xiàn)規(guī)范化種植(GAP)。這將為其在將來的治療肝纖維化的新的臨床應(yīng)用帶來極大方便和良好前景。丹參已有抗肝纖維

3、的研究報(bào)道，丹參酮ⅡA有促進(jìn)HSC凋亡的初步研究。但是丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液還無相關(guān)報(bào)道。本課題通過研究該制劑體內(nèi)和體外的抗肝纖維化的作用和機(jī)制為其抗肝纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。對(duì)此藥新藥理作用的研究開發(fā)必會(huì)帶來廣闊的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 方法： 體外研究： 1．體外細(xì)胞的培養(yǎng)：表型活化的HSC-T<,6>細(xì)胞用含10﹪胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基。置于37℃，5﹪CO<,2>恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)

4、胞呈單層貼壁生長至80﹪～90﹪時(shí)進(jìn)行傳代 2．臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)HSC-T<,6>細(xì)胞存活率3．MTT比色法檢測(cè)丹參酮HA磺酸鈉注射液對(duì)HSC-T<,6>細(xì)胞增殖的影響4．細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)5．放免法檢測(cè)丹參酮пA磺酸鈉注射液對(duì)HSC分泌Ⅳ型膠原(cⅣ)的影響6．ELISA法檢測(cè)丹參酮пA磺酸鈉注射液對(duì)HSC分泌TGF-β<,1>蛋白的影響7．流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹參酮пA磺酸鈉注射液對(duì)HSC凋亡率的影響8．對(duì)照組與藥物組培

5、養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察丹參酮пA磺酸鈉注射液對(duì)HSC細(xì)胞作用后的形態(tài)9．熒光染色觀察正常、凋亡和死亡HSC體內(nèi)研究1．模型制備：河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買清潔級(jí)大鼠108只，除正常對(duì)照組外各受試動(dòng)物均采用未滅活豬血清腹腔注射，2次/周，每次0.5ml/只，連續(xù)8W。 2．病理標(biāo)本的制備：取肝臟左葉相同部位，常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，做HE染色觀察肝細(xì)胞變性、壞死程度3．放免法檢測(cè)血清纖維化指標(biāo)HA、LN、PC Ⅲ及

6、Ⅳ-C的含量變化結(jié)果： 體外 1．隨著丹參酮HA磺酸鈉注射液作用時(shí)間延長和藥物濃度遞增，HSC增值抑制的效應(yīng)逐漸明顯，并表現(xiàn)出良好的量-效相關(guān)性和時(shí)．效相關(guān)性。 2．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可見隨著藥物濃度的增加HSC分裂增殖趨于緩慢，細(xì)胞外形也從不規(guī)則的星形、梭形等變?yōu)闄E圓形，圓形，并有碎裂現(xiàn)象。 3．丹參酮пA磺酸鈉注射液對(duì)于HSC的抑制作用不是非特異性細(xì)胞毒性所致。 4．Ⅳ型膠原含量隨著藥物濃度的增加

7、而逐漸減少，各藥物組和對(duì)照組之間差異具有顯著性。 5.TGF-β<,1>蛋白含量隨著藥物濃度而逐漸減少。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比TGF-β<,1>蛋白含量均有顯著性差異。 6．HSC的凋亡率隨藥物濃度增加而增加具有一定的量一效關(guān)系。 體內(nèi) 動(dòng)物情況：正常對(duì)照組發(fā)育良好，活動(dòng)正常。模型組動(dòng)物狀態(tài)一般，體重增加緩慢但無顯著性差異，藥物組狀態(tài)比模型組較好。 病理觀察：空白對(duì)照組肝臟中肝小葉分界不清，結(jié)構(gòu)完整，

8、無壞死，無炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生(圖1)。模型組肝組織病理損害嚴(yán)重，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉周圍明顯壞死，形成假小葉，經(jīng)過丹參酮HA磺酸鈉注射液給藥后，高、中、低劑量預(yù)防組和治療組均未出現(xiàn)假小葉，并且高、中劑量組纖維增生較少，局限于匯管區(qū)，肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂。(圖3圖4)；低劑量組療效較差，纖維組織由匯管區(qū)向周圍延伸(圖5)。 丹參酮HA磺酸鈉注射液對(duì)血清HA、CⅣ、PCⅢ、LN的影響：模型組與正常對(duì)照組相比，大

9、鼠血清中的HA、CⅣ、PCⅢ、：LN顯著升高。與模型組相比，丹參酮Ⅱ A磺酸鈉各劑量組的預(yù)防組和治療組均在不同程度出現(xiàn)大鼠血清中HA、CⅣ、PCⅢ、LN顯著降低，且高劑量組的降低最多。 結(jié)論： 體外 1.丹參酮HA磺酸鈉注射液隨著作用時(shí)間延長和藥物濃度遞增，HSC增值抑制的效應(yīng)逐漸明顯，并呈現(xiàn)出良好的量．效和時(shí)．效關(guān)系；并使HSC形態(tài)發(fā)生變化。 2.丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液體外能抑制：HSCⅣ型膠原合成、T