1、胰升血糖素樣多肽-1(GLP-1)是由小腸黏膜內(nèi)分泌L細胞合成并分泌的腸促胰島素激素。GLP-1的主要作用是在胰腺內(nèi)，包括血糖依賴性的增加胰島p細胞分泌胰島素和抑制胰島α細胞釋放胰升血糖素；促進胰島β細胞增殖和再生，抑制胰島β細胞凋亡，從而提升胰島β細胞質(zhì)量和胰島β細胞功能。另外，GLP-1還可以增加外周組織如肝臟和肌肉的胰島素敏感性，減少腸蠕動，增加飽感和減輕體重。天然GLP-1在體內(nèi)的半衰期很短，不足2分鐘，這限制了天然GLP-1在

2、臨床的應用價值。因此，目前對GLP-1的研究重點之一就放在了延長其的作用時間。GLP-1類似物顯著延長了GLP-1在體內(nèi)的作用時間，但是仍然需要每天或者每周給藥。GLP-1的基因治療，起到了很好的調(diào)控血糖的作用，但是在這些方法中，GLP-1的DNA是仍游離存在于靶細胞基因組外，不能實現(xiàn)GLP-1在體內(nèi)長期作用。
　　腺相關病毒(AAV)是一種非病原性的復制缺陷型人類病毒，能夠特異的將其基因定點整合到人基因組19號染色體長臂(19q

3、13.4)的特定位點(AAVS1)。AAVS1位點被證實是一個安全的可用于外源基因整合的位點。所以，來源于AAV的重組載體，具有不引起轉(zhuǎn)導細胞免疫反應和插入性突變的特點，并能介導轉(zhuǎn)基因的長期表達。以上特點使重組AAV載體成為目前理想的基因治療載體。對AAV的研究發(fā)現(xiàn)，其表達的Rep68/78蛋白和基因組中的RBE元件能夠有效的介導AAV的基因組整合。但是由于Rep68//78蛋白還有基因組復制的功能，重組AAV病毒載體系統(tǒng)失去了基因組整

4、合能力。所以，我們需要尋找一種新的基因治療策略，使重組AAV載體既能有效轉(zhuǎn)染靶細胞，又能將轉(zhuǎn)基因定點整合到AAVS1位點。
　　在這里，我們采用了一種非病毒的基因治療策略：構(gòu)建2個載體，一個載體用于表達Rep78蛋白，即Rep78/VRnew，另外一個載體用于表達我們的GLP-1/Fc蛋白，并且在GLP-1/Fc啟動子的上游插入一個RBE元件，即RBE/GLP-1/Fc；我們設想將這2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移進入靶細胞后，短暫表達的Rep78

5、蛋白協(xié)同RBE元件將引導GLP-1/Fc的DNA整合到細胞基因組中。使用PCR結(jié)合DNA雜交的方法檢測基因組整合。我們的結(jié)果顯示，GLP-1/Fc以一種Rep78蛋白依賴的方式整合到293細胞基因組的AAVS1位點。使用肌肉注射及電擊的方法將質(zhì)粒RBE/GLP-1/Fc和Rep78/VRnew轉(zhuǎn)移到AAVS1轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉細胞中，我們發(fā)現(xiàn)GLP-1/Fc基因整合到轉(zhuǎn)基因小鼠的AAVS1位點，而沒有整合到與肝癌密切相關的插入性突變位點m

6、ir-341位點。隨著基因組的整合，利用免疫組織化學方法在DNA注射部位檢測到GLP-1/Fc融合蛋白的表達，利用酶連免疫吸收實驗(ELISA)檢測到循環(huán)中活性GLP-1的水平持續(xù)升高。在高脂飲食(HFD)的小鼠模型，結(jié)果證實GLP-1/Fc基因治療明顯延緩了小鼠的體重增長和進食量。而且，GLP-1/Fc治療小鼠的血脂(甘油三脂)水平降低、激素Leptin和Ghrelin水平恢復到正常水平。并且，GLP-1/Fe治療顯著提升了外周組織的