1、目的：白細胞介素3受體α鏈(IL-3Rα鏈)即CD123抗原,是特異識別并結(jié)合白細胞介素3(IL-3)的關(guān)鍵部位,在急性髓系白血病(AML)干細胞表面高表達,同時在正常造血干細胞表面幾乎不表達。力達霉素是烯乙二炔家族的一個新成員,主要由輔基蛋白和發(fā)色團兩部分組成,可以拆分和重組,是一種新型高效的細胞毒藥物,已經(jīng)進入Ⅱ期臨床。本實驗,希望結(jié)合二者的靶向和高效殺傷優(yōu)勢,制備一種能夠針對AML干細胞的新型有效藥物。
　　 方法：利用D

2、NA重組方法構(gòu)建了一個以CD123為靶點、力達霉素為彈頭藥物的融合蛋白IL3-LDM,并采用蛋白質(zhì)譜與基因工程相結(jié)合的方法對其穩(wěn)定性進行鑒定和優(yōu)化改造,構(gòu)建mIL3-LDM。通過IPTG誘導表達得到可溶性蛋白后,經(jīng)HIS6鎳柱純化,通過SDS—PAGE并western blot鑒定蛋白特性,通過BCA定量和IL3 ELISA定量確定蛋白產(chǎn)量及純度。流式細胞術(shù)(FACS)、熒光顯微鏡和激光共聚焦確定融合蛋白與CD123+的細胞系及病人臨床

3、標本的結(jié)合活性后,CCK-8檢測該蛋白的細胞系殺傷效果,克隆形成實驗檢測病人臨床標本的干細胞殺傷率。
　　 結(jié)果：經(jīng)改造后的融合蛋白mIL3-LDM,穩(wěn)定性提升同時最大限度的保留了兩部分的全部活性。純化后的蛋白mIL3-LDM表達量約為1mg/l,純度可達95％,FACS測定融合蛋白與靶細胞的結(jié)合活性與CD123表達陽性率成正比。體外,無論是細胞系還是AML病人細胞標本,mIL3-LDM對CD123+的細胞系及AML干細胞均有很