1、第一部分：兒童急性淋巴細(xì)胞白血病Bcl-2基因表達、細(xì)胞凋亡與臨床相關(guān)性研究 目的：了解凋亡抑制基因Bcl-2表達與細(xì)胞凋亡和臨床的關(guān)系。 方法：利用細(xì)胞原位雜交技術(shù)和吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)熒光染料雙重染色檢測20例正常對照兒童和30例ALL患兒治療前后不同時期Bcl-2mRNA表達和細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：93.3％ALL患兒存在Bcl-2mRNA陽性表達，并隨著治療好轉(zhuǎn)其表達率下降，而正常對照組無表達。病

2、例組中Bcl-2mRNA表達水平存在明顯的個體差異(CV=38.7％)。根據(jù)ALL患兒Bcl-2mRNA表達水平將其分為高表達(＞20％)和低表達(≤20％)兩組。Bcl-2mRNA表達水平與ALL臨床分型關(guān)系密切，高危型者陽性細(xì)胞率高，與標(biāo)危者比較差別有極顯著性(t=11.50，P＜0.01)。但與患兒年齡、性別、血紅蛋白量、血小板及骨髓幼稚細(xì)胞比例無關(guān)(P＞0.05)。ALL治療前自然凋亡指數(shù)(AI)為(8.58±3.24)％，較正

3、常對照組明顯減低(t=5.42，P＜0.01)。治療前Bcl-2mRNA表達水平與AI呈負(fù)相關(guān)(r-0.76，P＜0.01)。經(jīng)潑尼松敏感治療和誘導(dǎo)緩解治療，AI明顯升高，且AI升高程度在Bcl-2mRNA低表達組顯著高于高表達組(t分別為4.54；4.01，P均＜0.01)。誘導(dǎo)緩解治療第19天骨髓檢查，Bcl-2mRNA低表達組完全緩解率高于高表達組(P=0.0012)。動態(tài)觀察5例高危型患兒Bcl-2mRNA表達水平始終在10％以

4、上，12月內(nèi)有3例出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，2例骨髓復(fù)發(fā)。而5例標(biāo)危型患兒Bcl-2mRNA水平始終在較低水平，陽性細(xì)胞率＜5％，骨髓檢查持續(xù)完全緩解，且無髓外白血病發(fā)生，其中1例患兒在24月時，Bcl-2mRNA表達高達20％，于28月時骨髓復(fù)發(fā)。 結(jié)論：1、ALL患兒存在程度不同的Bcl-2mRNA陽性表達，其表達水平與同期細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，且與臨床分型、早期治療反應(yīng)和早期骨髓緩解程度密切相關(guān)。2、治療前檢測Bcl-2mR

5、NA有利于危險程度的評估和原發(fā)耐藥的評價。3、動態(tài)檢測有利于繼發(fā)耐藥的評估，可作為化療敏感性的可靠指標(biāo)。 第二部分：兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病T細(xì)胞受體基因重排與臨床研究 目的：探討T細(xì)胞受體基因的Vδ2Dδ3重排片斷在兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病中的臨床意義。 方法：以TCRVδ2Dδ3重排片斷為白血病細(xì)胞的克隆特異性標(biāo)志，筑巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested-PCR)方法定性檢測白血病細(xì)胞的存在與否。 結(jié)果：對

6、58例ALL進行了TCRVδ2Dδ3基因重排檢測，在41例B-ALL中，34例(83％)和4例T-ALL中1例檢出克隆性TCRVδ2Dδ3基因重排。58例ALL中44例155次進行了TCRVδ2Dδ3基因重排的動態(tài)檢測。維持強化治療期間，TCRVδ2Dδ3基因重排檢測由陰性轉(zhuǎn)為陽性或持續(xù)陽性者，易引起骨髓復(fù)發(fā)，預(yù)后差。經(jīng)系統(tǒng)性治療3年以上，TCRVδ2Dδ3基因重排持續(xù)陰性者，可作為停藥治療的一個有效指標(biāo)。 結(jié)論：1、ALL患兒

7、存在著TCRVδ2Dδ3基因重排，在B-ALL中，TCRVδ2Dδ3基因重排陽性率高達83％。2、檢出TCRVδ2Dδ3基因重排，提示體內(nèi)存在白血病細(xì)胞。3、動態(tài)檢測對判斷療效、預(yù)測復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療和決定終止治療時間均有重要的臨床意義。 第三部分：尼莫地平對兒童急性非淋巴細(xì)胞性白血病化療增效的研究 目的：了解鈣道拮抗劑尼莫地平在兒童急性非淋巴細(xì)胞性白血病的化療增效效應(yīng)。 方法：28例患兒采用DA(柔紅霉素+阿糖胞苷

8、)方案治療2個療程，骨髓原始+早幼粒細(xì)胞仍＞20％，在原DA方案的基礎(chǔ)上加用尼莫地平(30mg/m2.d×7d)化療1療程。 結(jié)果：13例患兒達完全緩解，完全緩解率為46.4％，14例達部分緩解，1例未緩解，總有效率為96.4％。 結(jié)論：尼莫地平能增強DA方案對兒童急性非淋巴細(xì)胞性白血病的治療效果。 第四部分：尼莫地平對阿糖胞苷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡影響的研究目的：了解鈣通道拮抗劑尼莫地平(NMDP)對阿糖胞苷誘

9、導(dǎo)HL-60細(xì)胞株凋亡的影響。 方法：以HL-60細(xì)胞株為研究對象(AFS)，DNA凝膠電泳檢測各實驗組HL-60細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：①一定濃度的阿糖胞苷能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞株凋亡，其中以0.1mg/ml組凋亡率最高，24h凋亡率(70.00±2.00)％，1mg/ml組最低，24h為(14.33±1.53)％，同時伴有壞死細(xì)胞增多。同一濃度的阿糖胞苷其凋亡率隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。②單獨應(yīng)用NMDP無誘導(dǎo)HL-60細(xì)

10、胞凋亡的作用。③NMDP與阿糖胞苷合用HL-60細(xì)胞凋亡率明顯高于單純阿糖胞苷組。 結(jié)論：阿糖胞苷能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，單純應(yīng)用NMDP不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，NMDP與阿糖胞苷合用能明顯增強阿糖胞苷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的效果。 第五部分：尼莫地平加強阿糖胞苷誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡的機制研究 目的：探討尼莫地平(NMDP)加強阿糖胞苷(Ara-c)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用機制，為尼莫地平在臨床上逆轉(zhuǎn)白血病耐藥提

11、供理論依據(jù)。 方法：以HL-60細(xì)胞株為研究對象，采用Giemsa染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細(xì)胞的DNA片斷，采用細(xì)胞免疫組化方法檢測凋亡細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax的蛋白表達。 結(jié)果：實驗組自培養(yǎng)8小時起，HL-60細(xì)胞可見不同程度的變形、體積變小、出泡，小泡散落于細(xì)胞周圍。細(xì)胞和小泡仍保持膜的完整性。隨著培養(yǎng)時間延長，出泡細(xì)胞增加，細(xì)胞體積變小，密度減少，且伴有細(xì)胞壞死現(xiàn)象。Giem

12、sa染色可見核膜裂解，染色質(zhì)呈紫紅色或藍紫色，分割成塊狀，濃縮、靠近核膜，呈邊集現(xiàn)象，并具有典型的凋亡小體形成。瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)典型的DNA梯形凋亡帶。Bcl-2蛋白表達在各實驗組隨培養(yǎng)時間延長逐漸下降，而Bax蛋白的表達則逐漸增加，Bcl-2/Bax比值逐漸下降，8小時就與對照組出現(xiàn)差異(P＜0.05)。 結(jié)論：.尼莫地平及Ara-C均能促進HL-60細(xì)胞凋亡，其機制與下調(diào)bcl-2及上調(diào)Bax基因的蛋白表達有關(guān)。尼莫地平的