1、第一部分 目的：應(yīng)用髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)主動免疫出血性卒中大鼠，進(jìn)行行為學(xué)觀察，及免疫組化研究，探討膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)和神經(jīng)微絲蛋白200(Neurofilament protein,NF200)在血腫周圍腦組織的陽性表達(dá)，并應(yīng)用電鏡觀察血腫周圍腦組織的超微結(jié)構(gòu)變化，研究MBP對出血性卒中大鼠繼發(fā)性腦損害的神經(jīng)保護(hù)作

2、用。 方法：健康成年雌性SD大鼠，用自體動脈血注射法制備大鼠腦出血模型后12小時，進(jìn)行行為學(xué)評分，以2分者作為納入標(biāo)準(zhǔn)。入選84只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為MBP、卵白蛋白(Ovalbumin，VOA)、PBS和空白對照四組(n=21)。用不完全福式佐劑(Incomplete Freund’s Adiuvant，IFA)乳化的MBP(300μg/只)、VOA(200μg/只)、PBS(200μg/只)分別免疫三組SD大鼠，對照

3、組只做腦出血模型，于免疫后1、2、3、5、7、14、21天進(jìn)行行為學(xué)評分，并在免疫后1，3，5，7，14，21天處死動物，腦組織切片行GFAP及NF200免疫組織化學(xué)染色，于免疫后第7天每組大鼠取3只行電鏡檢查。 結(jié)果： (1)行為學(xué)評分：MBP免疫組大鼠在免疫后第1～3天行為學(xué)評分明顯優(yōu)于VOA、PBS免疫組與對照組(P<0.05)； (2)GFAP免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色觀察：腦出血免疫后第1～5天，MBP組血腫

4、周圍GFAP陽性細(xì)胞數(shù)與VOA、PBS及對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，后三組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腦出血免疫后第7～21天，各組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)相比無明顯差異(P>0.05)。 (3)NF200免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色觀察：MBP組NF200陽性細(xì)胞數(shù)在免疫后第3～14天與后三組相比有顯著性差異(P<0.05)，后三組之間相比無明顯差異(P>0.05)。 (4)透射電鏡觀察：在腦出血免疫后第7天，MB

5、P免疫組神經(jīng)元細(xì)胞和有髓神經(jīng)纖維的亞細(xì)胞器較豐富，神經(jīng)微絲排列整齊，未發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫。而其他三組神經(jīng)元細(xì)胞和有髓神經(jīng)纖維的亞細(xì)胞器變形或消失，神經(jīng)微絲排列紊亂，同時可見血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫。 結(jié)論：(1)MBP主動免疫能促進(jìn)GFAP和。NF200的陽性表達(dá)； (2)MBP免疫組行為學(xué)觀察及血腫周邊超微結(jié)構(gòu)的改變明顯好于其他組。MBP免疫治療能阻斷出血性卒中的繼發(fā)性腦損害，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)癥狀的改善，即血腫周圍神經(jīng)元的恢復(fù)；

6、 (3)MBP主動免疫激活自身效應(yīng)性T細(xì)胞透過血腦屏障，聚集在血腫周圍，在改善神經(jīng)元的微環(huán)境，阻斷腦出血后繼發(fā)性腦損害及對神經(jīng)元功能的恢復(fù)中發(fā)揮了重要作用。 第二部分 目的：研究大鼠出血性卒中后，MBP免疫治療對BDNFmRNA及蛋白表達(dá)的影響。探討MBP在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后對抗繼發(fā)性腦損害——即自身免疫神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制。 方法： (1)健康成年雌性SD大鼠，用自體動脈血注射法制備大鼠腦出血模型

7、后12小時，進(jìn)行行為學(xué)評分，參照Longa方法制定評分標(biāo)準(zhǔn)，以2分者作為納入試驗的標(biāo)準(zhǔn)。入選72只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為MBP、卵白蛋白VOA、PBS和空白對照四組(n=18)。用不完全福式佐劑乳化的MBP(300μg/ 只)、VOA(200μg/只)、PBS(200μg/只)分別免疫三組SD大鼠，于免疫后1、2、3、5、7、14、21天進(jìn)行行為學(xué)評分，在免疫后1，3，5，7，14，21天處死動物，腦組織切片行腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(br

8、ain derived neurotrophifactor,BDNF)免疫組織化學(xué)染色。 (2)同法制備36只SD大鼠出血模型，隨機(jī)分為MBP組、對照組(N=18)。腦出血后12h用IFA乳化的MBP(30μg/只)免疫M(jìn)BP組大鼠。于出血后1、3、5、7、14、21天采用RT-PCR法檢測兩組大鼠BDNFmRNA在血腫周圍腦組織的表達(dá)。 結(jié)果： (1)行為學(xué)觀察：MBP免疫組大鼠神經(jīng)學(xué)評分明顯優(yōu)于VOA、PBS

9、免疫組及對照組；BDNF的免疫組化檢測；BDNF主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，免疫后第1天，MBP組BDNF陽性細(xì)胞數(shù)與VOA組、PBS組、空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，免疫后第3天MBP組BDNF陽性細(xì)胞數(shù)與后三組相比有明顯差異(P＜0.05)，后三組之間相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；免疫后第5～21天，四組大鼠血腫周圍BDNF陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，各組相比無顯著性差異(P＞0.05)。 (2)BDNFmRNA RT

10、-PCR結(jié)果顯示：MBP組各時間點BDNFmRNA在血腫周圍腦組織中的表達(dá)均高于對照組，各時間點間兩組間比較均有明顯差異(P＜0.05)，尤其免疫后第5，7天兩組間有顯著性差異(P＜0.01).MBP組在第1，14天有兩個高峰，免疫后第1天分泌BDNFmRNA最高，免疫后第7天最低，第14天再次達(dá)到高峰。 結(jié)論：(1)大鼠腦出血后MBP主動免疫能上調(diào)BDNF蛋白及BDNFmRNA的表達(dá)，改善神經(jīng)元周圍微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元的存活及功