1、一般認(rèn)為缺氧或缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷可大致分為三個階段：(1)急性缺氧或缺血早期，其特征表現(xiàn)為膜通道的功能活動及膜電位的改變，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，如細(xì)胞內(nèi)Na+—、Ca2+、和細(xì)胞外K+離子的顯著增加等；(2)損傷相關(guān)的酶激活(蛋白酶、磷脂酶等)；(3)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于損傷性質(zhì)和細(xì)胞類型的不同，從急性缺氧缺血到延遲的細(xì)胞死亡發(fā)生所經(jīng)歷的時間可有很大差異(從數(shù)分鐘到數(shù)小時或數(shù)周)，其病理變化也有很大區(qū)別，包括最終引

2、起的神經(jīng)細(xì)胞的死亡也有不同方式，如壞死、凋亡等。而早期發(fā)生的離子穩(wěn)態(tài)失衡在缺氧缺血所致的神經(jīng)損傷過程發(fā)揮重要作用，至少包括以下三個方面：(1)缺氧早期引起的Na+和Ca2+在神經(jīng)細(xì)胞中的積聚是缺氧造成損傷的重要誘因；(2)缺氧或缺血早期對神經(jīng)元的影響幾乎只與離子穩(wěn)態(tài)的改變相關(guān)；(3)這些早期改變不僅決定細(xì)胞短期(即時)的命運(例如細(xì)胞損傷和壞死)，而且也將引起細(xì)胞的長期改變(例如代謝改變、酶的活化、基因激活及引起凋亡等)，即神經(jīng)元的很多

3、損傷性改變都繼發(fā)于離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)。因此，探討缺氧早期引起的離子穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制對于理解缺氧導(dǎo)致的病理生理改變及早期、晚期的病理損傷具有極其重要的意義。 實驗中采用急性分離的海馬CA1細(xì)胞和膜片鉗技術(shù)以及離體培養(yǎng)的原代神經(jīng)元和離子測定技術(shù)，觀察了急性缺氧誘導(dǎo)的電壓門控性鉀電流(全鉀電流、瞬間鉀電流IA、延遲整流鉀電流IK)、電壓門控性鈉電流(持續(xù)性鈉電流INaP、瞬間鈉電流INaT)的改變及HN對急性缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的通道功能改變的影響。

4、考慮到興奮性神經(jīng)毒和鈣離子超載在包括缺血/缺氧在內(nèi)的各種神經(jīng)病理中的重要作用，觀察了HN對谷氨酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+的影響，并初步探討了其機(jī)制。主要結(jié)果顯示：(1)急性缺氧造成電壓門控IK、INa電流的異常改變(電流幅度增加)；(2)HN(5μM)與缺氧同時作用于細(xì)胞，HN能夠拮抗缺氧誘導(dǎo)的IK、INaP電流的異常改變；(3)谷氨酸造成胞內(nèi)Ca2+明顯升高，HN(5μM)預(yù)處理抑制了谷氨酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+升高，其機(jī)制可能是HN通過抑制經(jīng)

5、谷氨酸受體的Ca2+內(nèi)流和保護(hù)線粒體的鈣緩沖能力而發(fā)揮作用。 上述結(jié)果顯示，離子穩(wěn)態(tài)失衡，包括缺氧引起的IK增加、INaP增加及[Ca2+]i增加，是缺氧引起的早期改變。這些改變可能通過影響膜電位(導(dǎo)致去極化)、影響興奮性、影響胞內(nèi)Ca2+(導(dǎo)致鈣超載)，及由此繼發(fā)性地引起其他病理改變，；在缺氧誘導(dǎo)的病理損傷過程發(fā)揮重要作用。HN通過抑制離子通道異?；顒雍头€(wěn)定線粒體的功能而維持離子穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)神經(jīng)元對抗缺氧/缺血和興奮毒造成的

6、損傷，即HN可對急性缺氧損傷提供有效保護(hù)。這些結(jié)果也支持HN可能具有廣譜的神經(jīng)保護(hù)作用的假說。 第一部分：HN對缺氧誘導(dǎo)的海馬CA1神經(jīng)元電壓門控性鉀電流異常改變的影響。 通道的異?；顒釉斐傻碾x子失穩(wěn)態(tài)被認(rèn)為是缺氧/缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的最初和關(guān)鍵的改變，包括缺氧缺血早期引起的細(xì)胞外鉀濃度增高。研究顯示，細(xì)胞內(nèi)鉀的外流與缺氧誘導(dǎo)的去極化密切相關(guān)，升高細(xì)胞外鉀濃度能夠模擬缺氧去極化，而缺氧去極化被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的重

7、要因素；此外鉀外流造成的細(xì)胞內(nèi)鉀的丟失引起神經(jīng)細(xì)胞皺縮、解除對caspase和核內(nèi)切酶的抑制作用從而介導(dǎo)凋亡過程。資料證實，持續(xù)性的細(xì)胞外高鉀可引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，而阻斷鉀外流可拮抗缺氧和缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。這些結(jié)果提示，維持鉀通道功能穩(wěn)定及鉀在細(xì)胞內(nèi)外正常分布在缺血損傷及保護(hù)中發(fā)揮重要意義。神經(jīng)元上的鉀通道包括五類，目前針對缺氧對鉀通道調(diào)制的研究大多數(shù)集中在KATP通道和KCa通道，而對電壓門控性鉀通道包括延遲整流鉀電流(IK)、瞬間

8、鉀電流(IA)在缺血、缺氧狀態(tài)下功能特性的改變研究甚少。 HN是一個內(nèi)源性神經(jīng)肽，最初被認(rèn)為只針對AD相關(guān)毒性的特異神經(jīng)保護(hù)作用。然而最近的研究提示，HN可能具有更為廣譜的保護(hù)作用。本實驗室前期工作也顯示，HN對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制包括抗凋亡和穩(wěn)定線粒體功能。 為了探討電壓門控性鉀通道在缺氧導(dǎo)致鉀離子穩(wěn)態(tài)失衡中的作用，以及HN急性處理對缺氧損傷可能發(fā)揮的影響，采用急性分離的海馬CA1細(xì)胞和膜片鉗技術(shù)

9、，觀察了急性缺氧對電壓門控性鉀通道(全鉀電流、瞬間鉀電流IA、延遲整流鉀電流IK)的作用及HN在常氧狀態(tài)(單獨作用)于缺氧狀態(tài)(與缺氧同時作用)下對鉀通道的影響。 結(jié)果顯示： 1)缺氧早期引起延遲整流鉀電流IK的增強(qiáng)，IK電流的增強(qiáng)是介導(dǎo)缺氧早期K+外流的主要途徑，并可能由此造成缺氧的損傷性改變及導(dǎo)致其他病理改變； 2)缺氧對瞬間鉀電流IA未產(chǎn)生明顯作用； 3)HN抑制缺氧引起的IK增強(qiáng)，這一作用可能通過

10、減輕K+分布的異常從而對缺氧/缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用； 4)HN在常氧和缺氧條件下都能增強(qiáng)IA電流幅度，其生理即病理生理意義尚不明確。以上結(jié)果提示，HN可能通過拮抗缺氧對電壓依賴性鉀通道的作用、維持鉀離子穩(wěn)態(tài)而對抗缺氧缺血引起的早期改變，從而對缺氧性腦損傷發(fā)揮有效保護(hù)作用。 第二部分：HN對缺氧誘導(dǎo)的海馬CA1神經(jīng)元電壓門控性鈉電流異常改變的影響。 缺氧早期發(fā)生快速的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，包括細(xì)胞內(nèi)先于胞漿Ca2+

11、的增高而發(fā)生的Na+增高。大量研究提示了鈉通道功能改變以及胞漿Na+增高在缺氧/缺血性損傷中發(fā)揮的作用。細(xì)胞外Na+內(nèi)流促進(jìn)缺氧去極化的發(fā)生；胞漿Na+增高不僅刺激鈉鉀泵的活動加快能量耗竭，而且通過逆轉(zhuǎn)Na+/Ca2+交換體的轉(zhuǎn)運方向從而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高，加劇隨之發(fā)生的細(xì)胞損傷。鈉通道阻斷劑和細(xì)胞外低Na+溶液可減少缺血或缺氧性細(xì)胞損傷和延遲的缺氧去極化，證明了鈉通道以及胞漿Na+增高在缺氧性損傷中所發(fā)揮的作用。 HN是最

12、近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性神經(jīng)肽，初始被認(rèn)為特異拮抗AD相關(guān)的神經(jīng)毒，然而新近的研究提示HN可能具有更為廣譜的神經(jīng)保護(hù)作用。本實驗室的前期工作顯示HN預(yù)處理能夠拮抗缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。 為探討HN對缺氧性損傷可能具有的保護(hù)作用及其作用的電生理機(jī)制，本研究采用了全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、急性分離海馬神經(jīng)元，觀察HN在常氧和缺氧狀態(tài)下對電壓門控性鈉通道(持續(xù)性鈉電流INaP瞬間鈉電流INaT)的作用。 結(jié)果顯示： 1)缺氧早期，不失活的

13、電壓門控鈉電流即持續(xù)性鈉電流INap的活動增強(qiáng)是引起[Na+]i升高的主要途徑，并可能繼而造成。Na+、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)、持續(xù)膜去極化和細(xì)胞損傷； 2)急性缺氧抑制瞬間鈉電流INaT； 3)HN急性處理能夠拮抗缺氧誘導(dǎo)的INaP增強(qiáng)，從而可能通過減輕Na+分布異常、及其繼發(fā)損傷而在缺氧早期發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。瞬間鈉電流INaT改變的生理及病理生理意義尚不明確。 第三部分：HN對谷氨酸誘導(dǎo)的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡的影響及機(jī)制

14、。 本實驗室以往的工作顯示，HN對缺氧和興奮毒損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用?？紤]到谷氨酸受體過度激活和鈣超載在缺氧缺血性腦損傷中的關(guān)鍵作用，本研究觀察在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，HN能否拮抗谷氨酸(500μM)所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，并初步探討可能的機(jī)制包括線粒體機(jī)制。 本研究以谷氨酸處理神經(jīng)元模擬缺血的神經(jīng)損傷，采用培養(yǎng)皮層神經(jīng)元Ca2+熒光成像技術(shù)觀察神經(jīng)元的[Ca2+]i；在急性分離神經(jīng)元采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察HN對谷氨酸

15、受體的作用。為探討HN對谷氨酸誘導(dǎo)鈣反應(yīng)的拮抗作用是否有線粒體鈣緩沖機(jī)制的參與，使用了線粒體解耦聯(lián)劑FCCP。FCCP可使線粒體質(zhì)子梯度、線粒體膜電位消失，從而導(dǎo)致將胞漿內(nèi)Ca2+攝取進(jìn)入線粒體內(nèi)的動力消失，因而抑制線粒體攝取Ca2+、并可促進(jìn)其釋放Ca2+。因此，在谷氨酸預(yù)處理引起鈣反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)期應(yīng)用FCCP，由FCCP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加可反應(yīng)谷氨酸暴露期間線粒體攝取Ca2+的量。 結(jié)果顯示： (1)HN(5μM)

16、能夠拮抗興奮毒濃度谷氨酸所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣升高； (2)這種拮抗作用部分通過穩(wěn)定線粒體功能以及恢復(fù)鈣緩沖能力而實現(xiàn)； (3)部分通過抑制經(jīng)谷氨酸受體的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而實現(xiàn)。 綜上結(jié)果，可得出如下結(jié)論： 1)缺氧誘導(dǎo)電壓門控性鈉、鉀通道電流的改變，提示電壓門控性鈉、鉀通道在缺氧早期發(fā)生的離子穩(wěn)態(tài)失衡中起重要作用。 2)缺氧早期引起延遲整流鉀電流IK的增強(qiáng)，這可能是介導(dǎo)缺氧早期K+外流、K+穩(wěn)態(tài)失衡

17、的主要途徑及損傷機(jī)制；缺氧對瞬間鉀電流IA未產(chǎn)生明顯作用，IA可能由于其快速失活的特性而在缺氧早期K+穩(wěn)態(tài)失衡中不起重要作用。 3)缺氧早期引起不失活的電壓門控鈉電流即持續(xù)性鈉電流INaP的活動增強(qiáng)，Na+經(jīng)INaP內(nèi)流是缺氧早期造成細(xì)胞內(nèi)Na+升高的主要途徑，并繼而引起Na+、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、持續(xù)的膜去極化和細(xì)胞損傷；急性缺氧抑制瞬間鈉電流INaT。 4)HN預(yù)處理可拮抗缺氧引起的IK、INaP增強(qiáng)。這一作用通過阻止