1、本文分為四部分： 第一部分：NMDA誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元神經(jīng)毒性作用觀察及機(jī)制 探討興奮性神經(jīng)毒是一個(gè)廣泛應(yīng)用的神經(jīng)損傷模型。雖有相關(guān)報(bào)道，但目前興奮性神經(jīng)毒的細(xì)胞模型在應(yīng)用NMDA的濃度、時(shí)間上差別很大。因此，為客觀評(píng)價(jià)HN的神經(jīng)保護(hù)作用，首先有必要摸索NMDA作用的濃度及時(shí)間，建立一個(gè)穩(wěn)定的神經(jīng)毒模型，以利于后續(xù)的一系列實(shí)驗(yàn)觀察。 方法：大鼠大腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)，純度達(dá)90％左右時(shí)，通過(guò)倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀

2、察、細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT及LDH釋放的檢測(cè))及胞內(nèi)Ca<'2+>的動(dòng)態(tài)測(cè)定，摸索NMDA毒性誘導(dǎo)的適當(dāng)濃度及時(shí)間，建立興奮性神經(jīng)毒的細(xì)胞模型。并通過(guò)ROS、NO檢測(cè)，分析模型中線粒體的損傷情況；通過(guò)電鏡觀察、TUNEL染色、caspase-3測(cè)定，研究模型中神經(jīng)元的凋亡情況；并進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)模型中caspase-8、caspase-9的活性，分析外源性和內(nèi)源性凋亡途徑在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮的作用。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS10.0處理獲得，以均數(shù)

3、士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均數(shù)的比較用one-way ANOVA分析和Dunnett多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。 結(jié)果：NMDA與皮層神經(jīng)元共同孵育，引起了培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變，以及由NMDA造成的時(shí)間和濃度依賴(lài)性的神經(jīng)元細(xì)胞活力的下降。而且，NMDA.(100μmol/L，2h)造成了大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力下降了47％，LDH釋放增加66％，皮層神經(jīng)元內(nèi)Ca<'2+>的快速升高，并維持在高水平形成一平臺(tái)，R

4、OS和NO的生成明顯增加，電鏡下凋亡形態(tài)出現(xiàn)，TUNEL染色陽(yáng)性，caspase-3、caspase-8和caspase-9活性明顯升高。 結(jié)論：NMDA(100μ mol/L)作用2h誘發(fā)了皮層神經(jīng)元明顯的細(xì)胞毒性，是一個(gè)比較理想的興奮性神經(jīng)毒模型。該模型觀察到了細(xì)胞整體的結(jié)構(gòu)及功能的損傷(MTT下降、LDH釋放增加、Ca<'2+>的快速升高)，也觀察到了線粒體功能的損傷。此外，該劑量的NMDA也誘發(fā)了皮層神經(jīng)元的凋亡，內(nèi)源性

5、和外源性凋亡途徑同時(shí)介導(dǎo)了該凋亡過(guò)程。 第二部分：Humsnin拮抗NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒的作用觀察 雖然HN被認(rèn)為是AD特異或AD相關(guān)毒性(AD-related insults)的神經(jīng)保護(hù)肽，然而，目前已積累的有關(guān)HN的細(xì)胞、分子水平的作用機(jī)制強(qiáng)烈提示，HN極有可能具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。本部分內(nèi)容擬在前期建立的大鼠大腦皮層神經(jīng)元的興奮性神經(jīng)毒細(xì)胞模型上，觀察HN是否通過(guò)拮抗興奮性神經(jīng)毒而發(fā)揮保護(hù)作用。 方

6、法：原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元，通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察并確認(rèn)NMDA毒性誘導(dǎo)的情況。 結(jié)果：1)HN抑制了NMDA引起的神經(jīng)元內(nèi)Ca<'2+>濃度的升高。2)HN抑制了NMDA引起的存活神經(jīng)元的減少。3)HN抑制了NMDA引起的神經(jīng)元細(xì)胞活力的下降。4)HN降低了NMDA引起的神經(jīng)元LDH的釋放。 結(jié)論：1)HN抑制了NMDA引起的神經(jīng)元內(nèi)Ca<'2+>濃度的升高；2)HN阻止了NMDA引起的細(xì)胞活力的下降，抑

7、制了NMDA所致的LDH釋放，拮抗了NMDA所致存活神經(jīng)元的減少。即HN可通過(guò)拮抗NMDA引起的興奮性神經(jīng)毒而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 第三部分：Humanin拮抗NMDA誘導(dǎo)的線粒體損傷的作用觀察 谷氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒通過(guò)過(guò)度激活NMDA受體，引起細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>超載，造成神經(jīng)元損傷，直至凋亡或壞死。線粒體既是細(xì)胞的能量工廠，又是重要的Ca<'2+>庫(kù)，在緩解細(xì)胞Ca<'2+>超載方面發(fā)揮重要作用。然而，

8、當(dāng)線粒體緩解Ca<'2+>的能力超過(guò)極限時(shí)，線粒體功能也遭到破壞，因此，興奮性神經(jīng)毒可造成線粒體功能的損傷。由于前期的實(shí)驗(yàn)觀察已證實(shí)，HN可拮抗NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒，包括抑制NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的升高，本部分內(nèi)容擬觀察HN通過(guò)拮抗NMDA造成的線粒體損傷而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元，通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察并確認(rèn)NMDA毒性誘導(dǎo)的情況。 結(jié)果：1)HN抑制了NMDA

9、引起的琥珀酸脫氫酶活性的降低。2)HN阻止了NMDA引起的線粒體膜電位(△Ψm)的降低。3)HN抑制了NMDA引起的ROS的生成。4)HN降低了NMDA引起的NO生成。 結(jié)論：1)HN抑制了NMDA引起的琥珀酸脫氫酶活性的降低；2)HN抑制了NMDA引起的線粒體膜電位(△Ψm)的降低；3)I-IN抑制了NMDA引起的ROS和NO的生成。即HN可能通過(guò)拮抗線粒體功能損傷在抑制興奮性神經(jīng)毒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 第四部分：Hu

10、manin拮抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的作用觀察 興奮性神經(jīng)毒使神經(jīng)元以凋亡或壞死兩種形式死亡。由于細(xì)胞凋亡是遲發(fā)性的、程序性的細(xì)胞死亡，因此被認(rèn)為是可控制和調(diào)節(jié)的，凋亡也因此成為研究的熱點(diǎn)。線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑是重要的凋亡途徑之一，而且還可以借助于Bid與外源性途徑發(fā)生聯(lián)系。因此，線粒體在凋亡的發(fā)生中處于無(wú)可替代的重要地位。前期研究發(fā)現(xiàn)，HN可拮抗。NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒，而且可拮抗NMDA誘導(dǎo)的線粒體損傷。那么，H

11、N是否可抑制NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡呢?本部分內(nèi)容擬觀察HN通過(guò)拮抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元，通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察并確認(rèn)NMDA毒性誘導(dǎo)的情況。 結(jié)果：1)電鏡觀察、TUNEL染色、caspase-3活性測(cè)定一致表示，NMDA誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡，而PI的流式細(xì)胞術(shù)定量分析及caspase-3活性測(cè)定顯示，HN可抑制NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。2)caspas

12、e-8和caspase-9活性測(cè)定顯示，外源性及內(nèi)源性凋亡途徑共同參與了NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中神經(jīng)元的凋亡，而HN對(duì)外源性凋亡途徑所致的神經(jīng)元凋亡有一定的抑制作用。3)通過(guò)使用caspase-8的抑制劑(IETD)并結(jié)合MTT和LDH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)外源性凋亡途徑在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的貢獻(xiàn)不大。因此，HN通過(guò)抑制外源性凋亡途徑對(duì)NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用也是有限的。4)通過(guò)使用總caspases抑制劑(VAD

13、)并結(jié)合MTT和LDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，caspase依賴(lài)的凋亡在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的貢獻(xiàn)不大。因此，HN通過(guò)抑制caspase依賴(lài)的凋亡對(duì)NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用也是有限的。5)通過(guò)使用caspase-8抑制劑，結(jié)合NO檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)caspase-8被抑制后NO水平降低，因此，HN可能通過(guò)抑制外源性凋亡途徑影響NO的生成。 結(jié)論：1)HN對(duì)NMDA誘發(fā)的皮層神經(jīng)元的凋亡具有一定的抑制作用；2)HN可能通過(guò)

14、抑制外源性途徑抑制NMDA誘導(dǎo)的凋亡；3)HN通過(guò)抑制caspases依賴(lài)的凋亡在抑制興奮性神經(jīng)毒中的作用并不明顯：4)HN可能通過(guò)抑制caspase-8的激活而抑制NO的生成，從而抑制NMDA通過(guò)NO造成的神經(jīng)損傷。 本文結(jié)論：1)NMDA(100μ mol/L)作用2h誘發(fā)了皮層神經(jīng)元明顯的細(xì)胞毒性，造成了線粒體損傷和神經(jīng)元凋亡，是一個(gè)比較理想的興奮性神經(jīng)毒模型；2)HN可通過(guò)拮抗NMDA引起的興奮性神經(jīng)毒而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用