1、腦卒中是老年人的常見病,發(fā)病率高,每年都呈上升的趨勢(shì)。并且腦卒中有很高的死亡率和致殘率。溶栓治療是目前唯一公認(rèn)有效的治療措施。但由于該方法時(shí)間窗短,繼發(fā)腦出血風(fēng)險(xiǎn)大,限制了其在臨床上應(yīng)用。研究有效的腦保護(hù)成為目前腦卒中研究的熱點(diǎn)。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system,KKS)廣泛的分布于人體的組織中,對(duì)人體產(chǎn)生多種病理和生理的作用,如血壓的調(diào)整、機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、腫瘤的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)和血管的再生等過

2、程。KKS廣泛的分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),在腦血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、炎癥、腫瘤等多種病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。組織型的激肽釋放酶(Tissue kallikrein TK)對(duì)腦梗死的作用一直是研究的一個(gè)熱點(diǎn),它對(duì)腦缺血的作用存在著爭(zhēng)議。有些研究表明,在大鼠腦缺血開始,應(yīng)用TK可以加重腦缺血區(qū)組織的炎癥反應(yīng),使腦缺血病變加重。有些人認(rèn)為,在腦缺血發(fā)生后,延遲使用TK(在8小時(shí)以后使用)可以減輕腦缺血病變,更有益于缺血腦組織的恢復(fù)。而且

3、這種保護(hù)作用主要是通過緩激肽(Bradykinin BK)B2受體發(fā)揮作用的。BK-B2R被阻滯以后這種保護(hù)作用消失。 本研究主要探討在大鼠腦缺血再灌注以后,延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)大鼠的腦缺血有無保護(hù)作用,對(duì)缺血區(qū)腦組織作用機(jī)制以及它對(duì)缺血區(qū)緩激肽及其受體的影響。我們擬通過本研究明確TK作用及其機(jī)制,以期為缺血型腦卒中提供新的治療靶點(diǎn)。 第一部分 組織型的激肽釋放酶對(duì)腦缺血再灌注大鼠的治療作用 目

4、的：探討延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的缺血區(qū)腦組織有無保護(hù)作用。 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成三組:A組為假手術(shù)組,B組為生理鹽水對(duì)照組,C組為TK治療組。大鼠腦缺血再灌注動(dòng)物模型的制作采用右側(cè)大腦中動(dòng)脈梗塞模型,缺血90分鐘后再灌注。生理鹽水對(duì)照組在大鼠腦缺血再灌注后8小時(shí),給予腹腔注射生理鹽水2ml·kg-1d-1,連續(xù)注射3天。TK治療組在大鼠腦缺血再灌注后8小時(shí),給予腹腔注射TK17.5PNAU·k

5、g-1d-1,連續(xù)注射3天。于術(shù)后第3天行神經(jīng)功能缺失評(píng)分(NSS),然后處死大鼠行梗死體積(TTC染色)的計(jì)算、缺血區(qū)的病理改變(HE染色)的檢查以及缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞情況(尼氏染色)的檢查,評(píng)價(jià)TK對(duì)腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用。 結(jié)果：在大鼠腦缺血再灌注后8小時(shí),給予TK治療能明顯降低大鼠的神經(jīng)功能缺損,使大鼠的梗死體積變小,與生理鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TK治療使大鼠缺血區(qū)的病理改變明顯減輕,使缺血

6、區(qū)的尼氏染色結(jié)果得到明顯的改善。 結(jié)論：延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的缺血區(qū)的腦組織有保護(hù)作用。 第二部分 組織型的激肽釋放酶對(duì)腦缺血再灌注大鼠的作用機(jī)制 目的：探討延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的缺血區(qū)的腦組織保護(hù)作用的機(jī)制。 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成三組:A組為假手術(shù)組,B組為生理鹽水對(duì)照組,C組為TK治療組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的制備方法及給藥情況同第一部分。從

7、以下五個(gè)方面探討TK的作用機(jī)制：1、對(duì)缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的影響,主要檢測(cè)缺血區(qū)的TUNEL染色和Caspase-3的免疫組化情況。2、對(duì)缺血區(qū)炎癥反應(yīng)的影響,主要檢測(cè)缺血區(qū)TNF-α、IL-6的免疫組化情況。3、對(duì)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞再生的影響,主要檢測(cè)缺血區(qū)NSE免疫組化情況。4、對(duì)缺血區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響,主要檢測(cè)缺血區(qū)GFAP免疫組化情況。5、對(duì)缺血區(qū)血管增生的影響,主要檢測(cè)缺血區(qū)vWF的免疫組化情況。 結(jié)果：在大鼠腦缺血再灌注8小

8、時(shí)以后應(yīng)用TK治療,缺血區(qū)的腦組織保護(hù)作用機(jī)制主要有：1、能明顯減輕腦缺血區(qū)的細(xì)胞凋亡,使腦缺血區(qū)的TUNEL染色、Caspase-3的免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞減少,與生理鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。2、能明顯減輕腦缺血區(qū)的炎癥反應(yīng),使腦缺血區(qū)TNF-α、IL-6免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞減少,與生理鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。3、能促進(jìn)腦缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的再生,使腦缺血區(qū)NSE免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞增多,與生理

9、鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。4、能促進(jìn)腦缺血區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生,使腦缺血區(qū)GFAP免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞增多,與生理鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。5、能促進(jìn)腦缺血區(qū)血管的增生,使腦缺血區(qū)的vWF免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞增多。 結(jié)論：延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的缺血區(qū)腦組織保護(hù)作用的機(jī)制主要是：抑制缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,促經(jīng)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的再生以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血

10、管內(nèi)皮細(xì)胞增生。 第三部分 組織型的激肽釋放酶對(duì)腦缺血再灌注大鼠的緩激肽及其受體的影響 目的：探討延遲應(yīng)用TK(在再灌注后8小時(shí)應(yīng)用)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的缺血區(qū)腦組織的BK及其受體的影響。 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成三組:A組為假手術(shù)組,B組為生理鹽水對(duì)照組,C組為TK治療組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的制備方法及給藥情況同第一部分。采用ELISA法檢測(cè)缺血區(qū)的緩激肽濃度。采用RT-PCR方法檢測(cè)缺血區(qū)腦組織的BK-B1R、BK-B

11、2R的mRNA表達(dá)情況。采用Western-blot方法檢測(cè)缺血區(qū)腦組織的BK-B1R、BK-B2R的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：在大鼠腦缺血再灌注8小時(shí)以后,應(yīng)用TK治療使腦缺血區(qū)BK的濃度升高。使腦缺血區(qū)BK-B1R輕度升高,與生理鹽水對(duì)照組相比無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);BK-B2R的mRNA表達(dá)明顯升高與生理鹽水對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。應(yīng)用TK治療使腦缺血區(qū)BK-B1R的蛋白表達(dá)輕度升高,使BK-