1、目的：采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法復制小鼠膿毒癥動物模型，觀察膿毒癥時小鼠脾臟淋巴細胞凋亡的情況，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78、CHOP基因mRNA及蛋白表達的變化，分析上述變化在脾淋巴細胞凋亡中的意義，以探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與膿毒癥脾淋巴細胞異常凋亡之間的關(guān)系。 方法：選擇體重為18-25g、雄性、C57BL/6小鼠60只，隨機分為假手術(shù)組(sham)30只，模型組(CLP)30只。術(shù)前12小時禁食，采用乙醚全麻。Sham組麻醉后開腹翻動

2、腸管尋找盲腸，但不做結(jié)扎和穿孔；CLP組開腹后找到盲腸，1號線行末端盲腸結(jié)扎，保留回盲瓣結(jié)構(gòu)和血運，18號針于結(jié)扎盲腸上穿孔1個，擠出少量糞便均勻分布于結(jié)扎盲腸表面，結(jié)扎盲腸還納腹腔后關(guān)腹，制成膿毒癥的動物模型。所有動物術(shù)后即刻用0.5ml生理鹽水皮下注射，進行液體復蘇。每組動物隨機等分，一半用于術(shù)后一般情況及生存率觀察，繪制生存率曲線；另一半術(shù)后存活時間大于24小時者，于術(shù)后24小時麻醉活殺，剖腹觀察腹腔情況后留取脾臟即刻液氮凍存和4

3、％多聚甲醛固定，分別用于組織勻漿的制備和病理組織學檢查。留取肝臟、肺、腸組織用于病理組織學檢查。采用終末脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的原位缺口末端標記術(shù)(TUNEL)檢測脾淋巴細胞凋亡情況。采用RT-PCR、免疫組化、WesternBlot檢測脾臟GRP78、CHOP基因mRNA及蛋白表達變化情況。SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示，以P<0.05或P<0.01作為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：1)膿毒癥

4、動物模型的確認施行CLP手術(shù)后的小鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應遲鈍、活動差、怕冷、聚居、豎毛、厭食、眼角分泌物增多等表現(xiàn)，24小時存活率達到93％左右，72h自然死亡率為33％。而Sham組術(shù)后表現(xiàn)與術(shù)前無異，且術(shù)后全部存活。多臟器組織病理切片檢查提示與Sham組比較，CLP組小鼠的肺臟、肝臟、脾臟、腸組織存在不同程度的損傷。2)脾淋巴細胞凋亡情況Sham組脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)出現(xiàn)少量、散在分布的凋亡淋巴細胞；CLP組脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)則見

5、大量、灶性分布的凋亡淋巴細胞。凋亡的嚴重程度以凋亡指數(shù)(ApoptosisIndex，AI)計算，CLP組與Sham組比較(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。3)脾組織GRP78的變化RT-PCR法檢測脾組織GRP78mRNA表達情況：Sham組和CLP組小鼠脾組織均可檢測到GRP78mRNA的表達，但CLP組小鼠脾組織GRP78mRNA相對表達水平明顯高于Sham組(P<0.05)。免疫組化與WesternBlot檢測脾組織GRP7

6、8蛋白的表達變化，表現(xiàn)為各組均有表達，但CLP組的表達量較Sham組增加(P<0.05)。4)脾組織CHOP的變化RT-PCR檢測脾組織CHOPmRNA的表達：Sham組CHOPmRNA表達較弱，而CLP組表達明顯增強，其相對表達水平比較P<0.05。免疫組化具有與WesternBlot相似的檢測結(jié)果：CHOP蛋白的表達量在CLP組多于Sham組(P<0.05)。 結(jié)論：1)膿毒癥脾淋巴細胞凋亡明顯增加，不僅導致淋巴細胞數(shù)目減少

7、，且凋亡細胞可通過造成免疫細胞無反應或抗炎細胞因子分泌等抑制機體免疫功能，成為膿毒癥免疫抑制的重要機制。2)CLP組脾淋巴細胞GRP78mRNA和蛋白表達增加，表明膿毒癥過程中由于缺氧、氧自由基釋放及酸中毒等刺激，脾淋巴細胞啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達等機制力圖糾正細胞功能紊亂。3)CLP組脾淋巴細胞CHOPmRNA和蛋白表達增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激刺激過于強烈和持久，以致超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的代償能力，因而啟動凋亡