1、I碩士學位論文利用酵母雙雜交方法篩選與豬瘟病毒NS3互作的細胞蛋白朱俊靈指導教指導教師：陳金頂教授學院名學院名稱：獸醫(yī)學院專業(yè)名專業(yè)名稱：微生物學答辯委員會主席：答辯委員會主席：郭霄峰教授中國廣州2016年6月學校代碼：10564學號：2013204720分類號：Q939.94密級：I摘要豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）是豬烈性傳染病豬瘟（Classicalswinefever，CSF）的病原菌，由

2、于豬瘟具有高發(fā)病率和死亡率，能對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失的特點，而被世界動物衛(wèi)生組織（OfficeInternationaldesEpizootiesOIE）和陸生動物法典列為法定報告的動物傳染病。CSFV的非結構蛋白NS3具有多種蛋白酶功能。研究發(fā)現，NS3能夠與CSFVRNA的3’UTR以及IRES結合，促進病毒的轉錄和翻譯。NS23復合體能夠影響病毒的復制和病毒粒子組裝。此外，NS3蛋白在細胞中的積累，會導致細胞病變。NS3由于能夠引起

3、宿主產生高水平的中和抗體，因而也被認為是能夠替代E2的潛在疫苗研發(fā)對象。本文為研究NS3蛋白對宿主的致病機制以及與宿主細胞蛋白的相互作用，采用酵母雙雜交技術，對豬外周血單核細胞中能與NS3蛋白進行互作的蛋白進行篩選，得到如下研究結果：（1）利用RTPCR擴增得到NS3基因，并成功構建pGBKT7NS3重組誘餌質粒。將重組質粒轉化Y2HGold酵母感受態(tài)細胞，經過檢測表明其無自激活作用，并且對酵母細胞沒有毒性作用。對Y2HGold(pGB

4、KT7NS3)表達蛋白用WesternBlot方法進行檢測，能夠得到約100kDa產物，說明NS3在酵母細胞中能夠表達，能夠用于文庫篩選。（2）對豬外周血進行分離，得到單核細胞，提取其總RNA。利用SMART技術合成cDNA第一鏈和dscDNA。利用CHROMASPINTE400對dscDNA進行純化，去除200bp以下的短片段后，與pGADT7Rec共轉化Y187酵母感受態(tài)細胞，制備cDNA文庫。經過檢測，發(fā)現文庫滴度為1.2107c

5、fumL，文庫庫容為6.0108。隨機挑取23個酵母菌落進行文庫多態(tài)性檢測，經過電泳檢測發(fā)現，文庫插入片段分布在500bp～3000bp之間，其中主要集中在1000bp～1500bp，重組率為91%。（3）利用pGBKT7NS3誘餌質粒對豬外周血單核細胞cDNA文庫進行篩選后，共獲得8個與NS3存在潛在互作的目的蛋白，分別為HAUS2，CTSV，βActin，PSMB10，LDHB，MARC1，ASB3和ETFA。關鍵詞：豬瘟病毒；NS