1、第一部分自然衰老大鼠胰島形態(tài)及胰島素分泌功能特點的觀察 觀察三種不同月齡的SD大鼠與糖脂代謝相關(guān)生化指標的變化，了解增齡對葡萄糖刺激胰島B細胞胰島素分泌、原位胰島素分泌、胰島形態(tài)的影響，明確衰老相關(guān)胰島B細胞形態(tài)功能變化的特點。 材料與方法:以6、12、20-24月齡SD大鼠為研究對象，普通飼料均衡喂養(yǎng)1--2月后，空腹12-14小時后將三組動物行腹腔麻醉，采心血查血糖、血脂、游離脂肪酸水平。然后分別行：1)衰老相關(guān)胰島

2、β細胞形態(tài)觀察：分離胰腺做HE染色，觀察三組不同年齡動物胰島形態(tài)學變化；用CAST體視學顯微鏡測量HE染色切片上單個胰島的平均體積；用電子顯微鏡觀察老年動物胰島β細胞中的胰島素的分泌顆粒；用胰島素免疫組化原位標記胰島β細胞中胰島素含量，了解在無葡萄糖刺激時胰島素的表達分泌情況。2)衰老相關(guān)胰島β細胞胰島素分泌功能觀察：分離純化胰島，分別在含5.6mmol/1和16.7mmol/1葡萄糖培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)，于2、4、6、12、24小時分別采

3、集培養(yǎng)液，用RIA法測定不同時間不同月齡動物胰島素濃度，了解葡萄糖刺激胰島分泌功能。 結(jié)果：與6月齡和12月齡的SD大鼠相比，20—24月齡大鼠體重、空腹血糖及血脂水平有增高，但無統(tǒng)計學差異；12-24月齡動物血清中FFA水平顯著增高(386.02±88.08；349.43±93.47 vs.263.93±68.77 mmol/l，p<0.05)；20-24月齡動物葡萄糖代謝受損，表現(xiàn)為：1)分離純化的胰島與含5.5mmol/1

4、葡萄糖靜置培養(yǎng)，葡萄糖刺激的胰島素分泌峰值減少(6.4±2.7 vs.13.97±1.23(6月)&12.08±0.76(12月)mU/1/30islets)，時間延遲(6h vs.2h)；與含16.7mmol/1葡萄糖培養(yǎng)24小時分泌總量明顯少于6月齡動物(3.51±2.07 vs.11.17±0.71 mU/1/30islets，P<0.05)。2)老齡鼠胰島B細胞占胰島面積的比例較大(72.99±29.65％vs.67.76±23

5、.48％(12月)&61.69±30.12％(6月))，但無顯著性差異； 3)胰島內(nèi)胰島素抗體免疫組化陽染面積顯著減少(19.81±8.56 vs.20.41±10.7(6月)&24.56±12.3(12月)×10<'4> μ m<'2>/切片，P<0.05)，平均光密度值隨著動物年齡的增加而降低(242.71±95.37(24月齡)，309±83.99(12月齡)vs.558±69.94(6月齡)，P<0.05)。以上發(fā)現(xiàn)說明老年鼠在

6、空腹血糖正常時即已具備胰島素抵抗的某些特征：如血FFA增高。對葡萄糖刺激出現(xiàn)峰值降低、達峰時間延遲的特點：另外雖然胰島面積在胰腺中比例有減少的趨勢，然而β細胞在胰島的比例卻略有增加，但細胞內(nèi)胰島素分泌量減少。 這些研究結(jié)果提示老年人胰島β細胞雖然增生，體積增大，但β細胞基礎(chǔ)和對葡萄糖刺激的胰島素分泌功能減低。說明一旦衰老糖代謝受損出現(xiàn)糖尿病，應(yīng)盡早考慮胰島素治療同時改善胰島素抵抗。 第二部分老齡大鼠胰島β細胞自吞噬現(xiàn)象觀

7、察 目的:通過觀察老年動物胰島β細胞中兩種細胞程序性死亡方式即；自體吞噬和細胞凋亡，初步了解二者和衰老的胰島β細胞分泌功能受損的關(guān)系。 材料與方法:將3種不同月齡SD動物(6、12、24月齡)均衡膳食1--2月后，空腹12--14小時，腹腔麻醉，迅速分離胰腺，固定、包埋后切片，通過透視電鏡對自體吞噬與調(diào)亡兩種細胞程序性死亡方式進行觀察，并用Tunel法對三組動物胰島β細胞進行免疫組化染色，用平均光密度值半定量分析。

8、 結(jié)果：通過透視電鏡，在20月齡動物胰島β細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量形態(tài)各異的自噬小體；同時發(fā)現(xiàn)老年鼠胰島β細胞胞漿中大量腫脹、空泡變性的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在12月齡動物胰島β細胞內(nèi)僅見到初級溶酶體，其內(nèi)未見吞噬細胞器。6月齡動物胰島β細胞內(nèi)則無類似發(fā)現(xiàn)。無論電鏡或Tunel法免疫組化染色均未觀察到凋亡。 結(jié)論與解釋:觀察發(fā)現(xiàn)衰老動物胰島β細胞中存在自吞噬的激活，但未見凋亡性細胞死亡。與本課題組前期的結(jié)果進行比對后發(fā)現(xiàn)，衰老對β細胞的影響與

9、高脂高糖誘導糖尿病大鼠中β細胞的改變有明顯區(qū)別：后者存在兩種死亡方式，而前者僅表現(xiàn)為自體吞噬作用的激活增強。推測衰老個體胰島β細胞中激活的自吞噬可能與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及變性有關(guān)，是細胞內(nèi)能量代謝障礙的結(jié)果，可能是導致增齡相關(guān)β細胞胰島素分泌功能障礙的機制之一。進一步量化自體吞噬可能有助于闡明兩者的關(guān)系。 第三部分自然衰老SD大鼠胰島素信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的研究 背景與目的:胰島素通過胰島素/胰島素受體途徑介導胰島素相關(guān)葡萄糖代

10、謝并通過胰島素/胰島素樣生長因子--1與衰老相關(guān)，兩者均可以通過P13K途徑影響絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶B(PKB，Akt)的表達。通過測定磷酸化Akt(p-Akt)在肝臟和骨骼肌中的表達，初步探討機體老化和葡萄糖代謝受損的機制。 材料與方法:將3種不同月齡SD動物(6、12、24月齡)均衡膳食1--2月后，空腹12—14小時，腹腔麻醉，迅速分離胰腺、肝臟、骨骼肌，固定、包埋后切片應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察IRS-1與p-Akt在不

11、同月齡大鼠胰腺、肝臟和骨骼肌中的表達，并MOD值半定量測定相關(guān)蛋白的表達。 結(jié)果：1)IRS-1在三組動物三種組織中均有表達。用MOD值定量分析發(fā)現(xiàn)與其它月齡大鼠相比，20--24月齡的大鼠無論胰島(240.70±77.14vs.266.92±54.92(12mon.)&360.73±23.89(6mon.))、肝臟(3905.09±579.04 vs.4045.60±974.79(12mon.)&5004.71±552.70(

12、6mon.))或骨骼肌(1571.07±748.50 Vs.1605.80±829.60(12mon.)&2356.80±875.85(6mon.))均表現(xiàn)為IRS-1的表達減少，但無顯著性差異(P>0.05)：2)老年鼠p-Akt在肝細胞中的表達顯著減少(2911.06±268.13 vs.4683.72±582.29(12mon.)&4903.06±688.44(6mon.)，P<0.05)，而在骨骼肌細胞中，三組動物p-Akt的表