1、IGF是國內(nèi)外目前的研究熱點(diǎn)，而鼻咽癌是具有中國特色的惡性腫瘤。目前尚未有IGFBP-6與鼻咽癌相關(guān)研究的報道，我們希望對IGFBP-6與鼻咽癌關(guān)系進(jìn)行深入的研究。本研究將分為三個部分進(jìn)行研究，第一部分是IGFBP-6表達(dá)與晚期鼻咽癌預(yù)后的關(guān)系；第二部分是IGFBP-6對鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響；第三部分是IGFBP-6對破骨細(xì)胞的形成及鼻咽癌骨質(zhì)破壞的影響。
　　 第一章 IGFBP-6表達(dá)與晚期鼻咽癌預(yù)后的關(guān)系

2、r>　　 目的：
　　 檢測鼻咽癌患者病理組織中IGFBP-6的表達(dá)，并對IGFBP-6的表達(dá)與鼻咽癌臨床特征與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 本組76例為1998年9月至2002年12月在我院行鼻咽活檢的鼻咽癌標(biāo)本。采用單克隆IGFBP-6抗體對76例鼻咽癌組織中的IGFBP-6表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測。按IGFBP-6的表達(dá)水平不同將患者分為兩組，分析IGFBP-6表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。采用SPSS1

3、3.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，兩因素間生存差異檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行頇后的多因素分析。
　　 結(jié)論：
　　 鼻咽癌組織中IGFBP-6有不同程度的表達(dá)，IGFBP-6的表達(dá)是鼻咽癌患者的局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險有關(guān)的因素，其陽性表達(dá)提示患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險降低。
　　 第二章IGFBP-6對鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響<

4、br>　　 目的：
　　 檢測鼻咽癌細(xì)胞珠IGFBP-6 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測IGFBP-6的自分泌：體外實(shí)驗(yàn)觀察IGFBP-6對鼻咽癌細(xì)胞珠增殖和侵襲的影響；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE2-IGFBP-6shRNA細(xì)胞，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討IGFBP-6基因干擾后對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響；探討IGFBP-6的可能作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 RT-PCR定性檢測鼻咽癌細(xì)胞珠IGFBP-6 mRNA的表達(dá)；熒光定量

5、RT-PCR檢測IGFBP-6 mRNA的定量表達(dá)；ELISA檢測鼻咽癌細(xì)胞珠IGFBP-6的自分泌。MTS檢測IGFBP-6對鼻咽癌細(xì)胞珠CNE2和HK-1的生長增殖的影響；Boyden侵襲小室檢測IGFBP-6對CNE2的侵襲能力的影響。采用陽離子脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及篩選表達(dá)IGFBP-6 shRNA載體的CNE2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時，根據(jù)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況來判斷轉(zhuǎn)染效果。熒光定量RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C

6、NE2-IGFBP-6 shRNA細(xì)胞中IGFBP-6在mRNA水平的表達(dá)；Western Blotting檢測干擾后IGFBP-6在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)動物分三組，每組5只免疫缺陷小鼠。分別在小鼠心臟注射CNE2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE2-IGFBP-6shRNA以及HK-1三種腫瘤細(xì)胞。每只小鼠注射50μl，約5×105個細(xì)胞。密切觀察小鼠的生長狀態(tài)，4周后將小鼠處死，處死前全身骨X片照射。解剖小鼠，暴露內(nèi)臟各器官，觀察

7、腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移情況，照相，并進(jìn)行病理取材。病理取材標(biāo)本處理后，石蠟包埋組織塊，病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。
　　 Western Blotting檢測靶基因的干擾效果，探討IGFBP-6的可能作用機(jī)制。
　　 結(jié)論：
　　 鼻咽癌細(xì)胞珠CNE2和HK-1均高表達(dá)IGFBP-6 mRNA。體外實(shí)驗(yàn)證明IGFBP-6能夠抑制CNE2增殖和侵襲的能力，體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)顯示IGFBP-6基因干擾后能夠在一定程度上促

8、進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞CNE2的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。IGFBP-6的作用機(jī)制可能與AKT的磷酸化、抑癌因子PTEN以及IGF-Ⅰ受體有關(guān)。
　　 第三章 IGFBP-6對破骨細(xì)胞的形成及鼻咽癌骨質(zhì)破壞的影響
　　 目的：
　　 體外實(shí)驗(yàn)檢測IGFBP-6對破骨細(xì)胞形成的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討IGFBP-6基因干擾后對鼻咽癌細(xì)胞的骨質(zhì)破壞能力的影響。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體Raw細(xì)胞，加入RANKL50n

9、g/ml及M-CSF10ng/ml的DMEM培養(yǎng)液促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟，并同時加予不同濃度的IGFBP-6，誘導(dǎo)6天后，形成成熟破骨細(xì)胞，行破骨細(xì)胞TRAP染色。小鼠骨髓細(xì)胞分離，用含有RANKL50ng/ml及M-CSF10ng/ml的α培養(yǎng)液促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟，同時加予不同的處理，分別為IGFBP-6、CNE2-CM(Conditiong Medium)、CNE2-CM+IGFBP-6-Ab(antibody)，誘導(dǎo)6天后，形成成熟破

10、骨細(xì)胞，行破骨細(xì)胞TRAP染色。
　　 實(shí)驗(yàn)動物分三組，每組5只免疫缺陷小鼠。分別在小鼠右側(cè)脛骨骨髓腔注射CNE2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE2-IGFBP-6 shRNA以及HK-1三種腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞的濃度調(diào)整為1×107cell/ml。每只小鼠注射50μl，約5×105個細(xì)胞。小鼠腫瘤細(xì)胞注射后，繼續(xù)飼養(yǎng)并密切觀察小鼠的生長狀態(tài)，4周后將小鼠處死，處死前全身骨X片照射。解剖小鼠，暴露內(nèi)臟各器官，觀察腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移情況，照相，并進(jìn)行病理

11、取材。病理取材標(biāo)本直接置10％福爾馬林溶液固定，經(jīng)處理后，石蠟包埋組織塊，病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察，病理玻片TRAP染色。
　　 結(jié)論：
　　 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示IGFBP-6能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)顯示IGFBP-6基因干擾后能夠在一定程度上抑制鼻咽癌細(xì)胞珠CNE2引起的骨質(zhì)破壞及破骨細(xì)胞形成的能力。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.鼻咽癌組織中IGFBP-6有不同程度的表達(dá)，IGFBP

12、-6的表達(dá)是鼻咽癌患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險有關(guān)的因素，其陽性表達(dá)提示患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險降低。
　　 2.鼻咽癌細(xì)胞珠CNE2和HK-1均高表達(dá)IGFBP-6 mRNA。體外實(shí)驗(yàn)證明IGFBP-6能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞珠CNE2的增殖和侵襲，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示IGFBP-6基因干擾后能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞CNE2的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。
　　 3.IGFBP-6能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，IGFBP-6基因干擾后能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞