1、一、背景和目的： 心律失常是常見而嚴重的應(yīng)激性疾病，已經(jīng)成為影響人類健康的重要因素。應(yīng)激誘發(fā)心律失常發(fā)生多數(shù)情況下是有心臟基礎(chǔ)病變存在的，而病變程度不同必然對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。目前鮮見報道有應(yīng)激誘發(fā)無心臟基礎(chǔ)病變動物發(fā)生心律失常的模型，亦無其分子機制方面的研究。單因素應(yīng)激模型適用于研究某一種應(yīng)激源在應(yīng)激疾病中的作用，急性應(yīng)激是以下丘腦-垂體-腎上腺軸反應(yīng)為主的機體功能變化，而應(yīng)激疾病的產(chǎn)生往往是多因素作用的慢性過程，慢性應(yīng)激才可

2、能有心臟電生理變化，因此，有必要建立一種慢性多重應(yīng)激模型并且可誘導(dǎo)動物心律失常發(fā)生，這將為心律失常機制的研究奠定基礎(chǔ)。 心律失常特別是心房顫動(房顫)嚴重危害人類健康，機制尚不明了，有多種學(xué)說，其中心房電重構(gòu)是研究的熱點之一。電生理重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房肌動作電位有效不應(yīng)期縮短，電重構(gòu)的基礎(chǔ)即離子通道的分子重構(gòu)。動作電位是心肌細胞的基本電活動，L-型鈣通道電流(ICa，L)是心肌細胞動作電位平臺期的主要內(nèi)向電流，L-型鈣通道電流的改

3、變可影響動作電位和平臺期電位水平，L-型鈣通道開放時間異常具有潛在的致心律失常作用。瞬間外向鉀電流(Ito)是在動作電位早期出現(xiàn)的外向鉀電流，其特點是對電壓依賴的快速激活和滅活。該電流的大小對動作電位的形態(tài)和時程有較大影響，是引起心肌復(fù)極化的重要鉀電流之一。因此，探討ICa，L和Ito的變化對于研究心律失常心房電重構(gòu)有重要意義。 心房電重構(gòu)時L-型鈣通道蛋白表達變化是通道電流變化的分子基礎(chǔ)，電壓依賴性鉀通道表達變化也參與重構(gòu)，但

4、對L-型鈣通道表達降低與否存在爭議。因此深入研究心律失常時心房肌L-型鈣通道和鉀通道表達變化有重大意義。心肌L-型鈣通道和鉀通道都有多個亞單位，各亞基發(fā)揮著不同的作用。在心律失常心房電重構(gòu)時各亞單位表達變化值得深入研究。 本研究建立大鼠慢性多重應(yīng)激模型，分析心臟自律性和心房肌細胞內(nèi)鈣濃度變化，探討L-鈣通道電流和瞬間外向鉀電流的重構(gòu)特點，并深入研究L-鈣通道和鉀通道各亞單位表達變化趨勢。用L-鈣通道阻滯劑維拉帕米干預(yù)，分析維拉帕

5、米對應(yīng)激性心律失常、鈣超載、電重構(gòu)和通道表達變化的抑制作用。 二、內(nèi)容和方法： 1.大鼠慢性多重應(yīng)激模型建立和應(yīng)激致大鼠心律失常的研究 1)用噪聲、足底電擊、強迫游泳、束縛以及夜間光照的復(fù)合刺激建立應(yīng)激模型。維拉帕米干預(yù)應(yīng)激刺激。觀察應(yīng)激動物行為變化，測量心率、血壓和食物利用率。采用高效液相色譜法測定血清NE和Epi濃度，放射免疫法測定血清ACTH和Cor濃度。 2)記錄心電圖，分析心律失常事件。用激光共

6、聚焦顯微鏡法測定心房肌細胞內(nèi)鈣離子濃度。 2.慢性多重應(yīng)激性大鼠心房肌電生理重構(gòu)研究 1)慢性多重應(yīng)激大鼠單個心房肌細胞的分離。 2)二步拉制法制作膜片鉗微電極，充灌電極液。 3)形成全細胞膜片鉗記錄模式。 4)記錄L-型鈣通道電流(ICa，L)和瞬時外向鉀通道電流(Ito)。用clampfit軟件制作I-V曲線。穩(wěn)態(tài)激活曲線由I-V曲線得到。穩(wěn)態(tài)失活曲線Boltzmann方程擬合。 3.

7、慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌L-鈣通道和鉀通道亞單位基因和蛋白表達變化研究 1)real time PCR方法測定L-型鈣通道α1c、α2/δ1、β1、β2、β3亞基和鉀通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亞單位基因表達。 2)L-型鈣通道。αlc、α2/δl、β1亞單位和鉀通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亞基蛋白表達變化(Western blot方法)。 三、結(jié)果： 1.慢性多重應(yīng)激大鼠心率、血壓、食

8、物利用和血清激素的變化 慢性多重應(yīng)激致大鼠心率明顯增加，到脫離應(yīng)激源仍維持在(508±18)b/min，應(yīng)激+維拉帕米組出現(xiàn)相似的變化趨勢，幅度較應(yīng)激組小。應(yīng)激組大鼠血壓在2w內(nèi)由(115±15)mmHg升高至(156±26)mmHg，應(yīng)激4w為(151±22)mmHg，與應(yīng)激前相比明顯增高(P<0.05)，應(yīng)激+維拉帕米組血壓漸進性升高，到應(yīng)激結(jié)束達到(137±14)mmHg，高于對照組(P<0.05)。應(yīng)激組和應(yīng)激+維拉帕米

9、組大鼠體重增長均較對照組慢，食物利用率低于對照組(P<0.05)。應(yīng)激組動物血清NE、Epi、ACTH和Cor均明顯增高。 2.慢性多重應(yīng)激大鼠心律變化 應(yīng)激組大鼠出現(xiàn)多種心律紊亂：竇性心動過速、竇性心律不齊、房性期前收縮、室性期前收縮、陣發(fā)性室速、室上速。應(yīng)激+維拉帕米組大鼠出現(xiàn)心律失常的時間較應(yīng)激組明顯延后(P<0.05)，且心律失常次數(shù)較應(yīng)激+維拉帕米組少(VPB：應(yīng)激組2.1±0.3 vs應(yīng)激+維拉帕米組0.7±

10、0.06，P<0.0.events/min，APB：應(yīng)激組1.8±0.4 vs應(yīng)激+維拉帕米組0.2±0.0.events/min，P<0.01)。 3.慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌細胞內(nèi)鈣濃度變化 應(yīng)激組心房肌細胞鈣離子濃度高于應(yīng)激+維拉帕米組和對照組(應(yīng)激組：215±26nmol/L vs應(yīng)激+維拉帕米組：101±15nmol/L；和對照組：65±11P<0.01，P<0.011。 4.慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌細胞I

11、Ca，L和Ito的變化 應(yīng)激組心房肌細胞ICa，L峰電流幅值pA/pF低于維拉帕米組和對照組(A組：-3.71±0.38，B組：-8.46±0.56，C組：-8.90±0.68；A vs B and C，P<0.01，B vs C，P<0.01)。應(yīng)激組半數(shù)最大激活電位(V1/2)明顯高于應(yīng)激+維拉帕米組和對照組(A組：4.23±0.33mV，B組：-10.09±1.97mV，C組：-13.17±2.44.mV；A vs B a

12、nd C，P<0.01，B vs C，P>0.05)。應(yīng)激組穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，半數(shù)最大失活膜電位(V1/2)較之于對照組和應(yīng)激+維拉帕米組明顯降低(A組：-25.35±2.55mV：B組：-9.19±1.76mV；C組：-0.77±0.14mV：A vs B and C P<0.01)。應(yīng)激組Ito峰電流幅度和峰電流密度比應(yīng)激+維拉帕米組和對照組明顯減小(pA/pF：A組：13.18±4.56mV；B組：20.64±7.53mV：C組：

13、25.31±7.58mV：A vs B and C P<0.011。 5.慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌L-鈣通道和鉀通道表達變化 應(yīng)激組和應(yīng)激+維拉帕米組L-型鈣通道α1c、α2/δ1、β1、β2、β3亞單位的mRNA表達水平低于對照組(P<0.01)，應(yīng)激組β1和β2亞基mRNA表達水平低于維應(yīng)激+拉帕米組(分別為P<0.05和P<0.01)。應(yīng)激組和對照組鉀通道Kvl.4，Kv4.2，Kv4.3亞單位的mRNA表達水平低于

14、應(yīng)激+維拉帕米組(P<0.01)，應(yīng)激組和對照組各亞基mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異。 應(yīng)激組L-型鈣通道α1c、α2/δ1、β1亞基和鉀通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亞基蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)。應(yīng)激+維拉帕米組鈣通道α1c、α2/δ1、β1亞基和鉀通道Kv1.4、Kv4.2亞基蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)，應(yīng)激+維拉帕米組鉀通道Kv4.3亞基蛋白表達低于對照組(P<0.05)。應(yīng)激組L.型鈣通道

15、α1c、β1亞基和鉀通道Kv1.4亞基蛋白表達明顯低于應(yīng)激+維拉帕米組(分別為P<0.01，P<0.05，P<0.05)。 四、結(jié)論： 1.成功建立了大鼠慢性多重應(yīng)激模型，應(yīng)激大鼠出現(xiàn)房性期前收縮和室性期前收縮等多種心律紊亂，一般行為發(fā)生了變化，心率增快，血壓升高。 2.慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細胞內(nèi)鈣超載。心房肌發(fā)生電生理重構(gòu)，表現(xiàn)為心房肌細胞L-型鈣通道電流(ICa，L)和瞬間外向鉀通道電流(I

16、to)下調(diào)，L-型鈣通道激活電位升高，失活電位降低。心房肌細胞內(nèi)鈣超載和心房肌電生理重構(gòu)可能是慢性多重應(yīng)激誘導(dǎo)的心律紊亂的分子基礎(chǔ)。 3.慢性多重應(yīng)激大鼠心房肌L.型鈣通道α1c、α2/δ1、β1亞基和鉀通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亞單位基因和蛋白表達降低，分別是心房肌ICa.L和Ito降低的分子基礎(chǔ)。提示L-型鈣通道和鉀通道表達降低可能是心房肌電生理重構(gòu)的重要分子機制。 4.預(yù)用維拉帕米可抑制慢性多重應(yīng)激誘導(dǎo)