1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies viurs，PRV）屬皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科（Alpha-herpesviridae），可致多數(shù)動(dòng)物感染發(fā)病，并能引起豬的潛伏感染。豬是其主要宿主和病毒攜帶者，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害重大。在2011年之前，由于PRV gE缺失疫苗的廣泛使用，國(guó)內(nèi)的PRV疫情得到了很好的控制，但從2011年底開(kāi)始，PRV疫情突然大面積爆發(fā)，傳統(tǒng)的gE缺失疫苗已被證實(shí)無(wú)法提供完全有效的

2、免疫保護(hù)，使得國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大的威脅。本研究對(duì) PRV新流行毒株進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其主要糖蛋白的分子特征進(jìn)行了分析；模仿 PRV Bartha株的gE缺失區(qū)域，構(gòu)建了PRV新流行毒株的gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，為新流行毒株gE缺失突變株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定
　　從安徽某免疫PRVBartha K61疫苗豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒中采集腦、心、肝、脾、肺、腎，經(jīng) PCR擴(kuò)增，結(jié)果從腦

3、、肝、脾、肺中檢測(cè)到PRV gE基因陽(yáng)性。將腦組織研磨后接種BHK-21細(xì)胞，在37℃5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，病變細(xì)胞經(jīng) PCR檢測(cè)為 PRV gE陽(yáng)性；采用空斑純化方法純化了該病毒，并命名為PRV AH-China-2013。將病毒接種昆明小鼠，通過(guò)LD50測(cè)定評(píng)價(jià)了該病毒對(duì)小鼠的致病性，結(jié)果表明其LD50為104.15TCID50。
　　2、偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

4、　　提取PRV AH-China-2013基因組，采用PCR擴(kuò)增其主要糖蛋白基因gB、gC、gD、gE，經(jīng)測(cè)序后，將gC、gE基因分別與國(guó)內(nèi)外不同年代分離的PRV毒株進(jìn)行序列比對(duì)，通過(guò)mega5.0繪制PRV AH-China-2013株gC和gE基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)；通過(guò)PRV AH-China-2013gB、gC、gD、gE序列推導(dǎo)其氨基酸序列，并與國(guó)內(nèi)外不同年代分離的PRV毒株相應(yīng)糖蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，PRV

5、AH-China-2013株與國(guó)內(nèi)毒株（除2008年分離的7株毒株外）位于同一個(gè)分支，且與2011年來(lái)新分離毒株的遺傳關(guān)系更近，而與與國(guó)外毒株及疫苗毒株Bartha株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，表明PRV AH-China-2013株屬于PRV新流行毒株。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，與國(guó)外毒株相比，國(guó)內(nèi)株主要糖蛋白均存在明顯的氨基酸的缺失或插入，且部分突變位點(diǎn)位于相應(yīng)蛋白的關(guān)鍵功能域內(nèi)，這些突變是否導(dǎo)致病毒毒力及免疫原性的改變，進(jìn)而影響現(xiàn)有疫苗的免疫效果

6、，尚需進(jìn)一步證實(shí)。
　　3、偽狂犬病病毒新流行株gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
　　根據(jù)新流行毒株 PRV-ZJ01的基因組序列，在 gE基因上、下游設(shè)計(jì)長(zhǎng)度分別為838bp和961bp的基因片段作為同源重組的同源臂，即同源左臂 LA和同源右臂 RA；以 pEGFP質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含完整表達(dá)盒的綠色熒光蛋白基因 EGFP作為標(biāo)記基因。通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法，并按照 LA-EGFP-RA的順序，將 LA、RA、EGFP連

7、接到T載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建PRV gE缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為 pMD-LA-EGFP-RA。將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pMD-LA-EGFP-RA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可觀察到綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)，表明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢杂糜诤罄m(xù)同源重組試驗(yàn)。
　　本研究從分子水平上解析了PRV新流行株與疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遺傳差異，為進(jìn)一步深入研究 Bartha株疫苗免疫失敗的原因