1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分
　　實(shí)驗(yàn)一 慢性壓力超負(fù)荷致心肌肥厚模型的建立及大鼠雙孔道鉀通道TREK-1基因表達(dá)的變化
　　目的:探討慢性壓力超負(fù)荷致心肌肥厚狀態(tài)下,大鼠心臟雙孔道鉀通道TREK-1基因表達(dá)的變化。
　　方法:通過縮窄大鼠腹主動(dòng)脈4周建立壓力超負(fù)荷性心肌肥厚模型(CAA組),并設(shè)立正常對(duì)照組(Control)和假手術(shù)組(Sham)組。觀察期結(jié)束后,檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),然后取

2、心臟并分離左右心室,計(jì)算左心室濕重/體重(LVW/BW,mg/g)和右心室濕重/體重(RVW/BW,mg/g),分別為左右心室肥厚指數(shù)(LVMI,RVMI);左室心肌HE染色觀察壓力超負(fù)荷對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)的影響;應(yīng)用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測(cè)左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:CAA組大鼠左室收縮壓(LVSP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)及心率(HR)與對(duì)照組相比均存在

3、差異(P<0.01,P<0.05,P<0.05),但左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力上升最大速度(+dp/dtmax)、左室壓力下降最大速度(-dp/dtmax)無明顯變化;腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4周,大鼠左心室肥厚指數(shù)較對(duì)照組和假手術(shù)組明顯增加(P<0.05),光鏡下顯示心肌肥厚;與正常對(duì)照組相比,CAA組Real-time PCR和Western Blots結(jié)果顯示左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.

4、05)。
　　結(jié)論:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4周,可建立壓力超負(fù)荷性心肌肥厚模型,此時(shí)大鼠心功能仍處于代償期;慢性機(jī)械牽張可誘導(dǎo)雙孔道鉀通道TREK-1基因的表達(dá)增加,它們?cè)诜€(wěn)定心臟機(jī)械電反饋的過程中起重要作用。
　　第二部分
　　實(shí)驗(yàn)二 急性機(jī)械牽張心臟模型的建立及大鼠雙孔道鉀通道TREK-1基因表達(dá)的變化
　　目的:研究大鼠離體灌流心臟受急性機(jī)械牽張時(shí),雙孔道鉀通道TREK-1基因的變化。
　　方法:40只雄性

5、SD大鼠隨機(jī)分成8組,每組5只,分別行單純Langendorff灌流0min,30min,60min,90min(即L0、L30、L60和L90組)以及急性機(jī)械牽張0min,30min,60min,90min(即S0、S30、S60和S90組)。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機(jī)械牽張的心臟模型;應(yīng)用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測(cè)左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達(dá)

6、。
　　結(jié)果:單純行Langendorff灌流各組的雙孔道鉀通道TREK-1的mRNA和蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05);急性牽張0min、30min、60min組TREK-1的表達(dá)與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的單純灌流組比無明顯差異;急性牽張90min組與其他組比較,左室TREK-1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。
　　結(jié)論:一定時(shí)程的急性機(jī)械牽張可以上調(diào)離體灌流心臟左室TREK-1基因的表達(dá),它可能在心臟受額外機(jī)械牽張時(shí)

7、減少心臟心律失常的發(fā)生從而起到保護(hù)作用。
　　第三部分
　　實(shí)驗(yàn)一慢性壓力超負(fù)荷致心肌肥厚時(shí)大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的改變及MAPK在心肌細(xì)胞內(nèi)分布的變化
　　目的:探討慢性壓力超負(fù)荷致心肌肥厚狀態(tài)下,大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的變化以及MAPK在心肌細(xì)胞內(nèi)分布的改變。
　　方法:通過縮窄大鼠腹主動(dòng)脈4周建立壓力超負(fù)荷性心肌肥厚模型(CAA組),并設(shè)立正常對(duì)照組(Control)和假手術(shù)組(Sham

8、)組。觀察期結(jié)束后,取心臟并分離左右心室,計(jì)算左心室濕重/體重(LVW/BW,mg/g)和右心室濕重/體重(RVW/BW,mg/g),分別為左右心室肥厚指數(shù)(LVMI,RVMI)。利用(γ-32P)ATP體外標(biāo)記磷酸化方法進(jìn)行左室心肌PKC活性測(cè)定;采用Western Blots方法檢測(cè)左室心肌ERK1/2和p38 MAPK的蛋白含量及其磷酸化蛋白含量,以反映其活化水平;對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察左室心肌磷酸化ERK1/2激酶

9、和磷酸化p38 MAPK的細(xì)胞內(nèi)分布情況。
　　結(jié)果:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4周,大鼠左心室肥厚指數(shù)較正常對(duì)照組和假手術(shù)組明顯增加(P<0.05);與正常對(duì)照組相比,CAA組左心室ERK1/2激酶及p38MAPK蛋白總量未見明顯變化(P>0.05);術(shù)后4周,大鼠左室PKC活性、ERK1/2激酶活性及p38MAPK活性均增加(P<0.01);正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較,左室PKC活性、ERK1/2激酶活性和p38MAPK活性無明顯差異(P

10、>0.05);免疫組化結(jié)果顯示,行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后,大鼠左室ERK1/2和p38MAPK均發(fā)生明顯活化并伴核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論:慢性壓力超負(fù)荷致大鼠心肌肥厚時(shí)左室PKC、ERK1/2激酶和p38MAPK活性增加,且活化的ERK1/2激酶和p38MAPK集中于細(xì)胞核內(nèi),這提示PKC、MAPK在慢性機(jī)械刺激所致的心肌細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用,可能參與了慢性機(jī)械刺激所致心肌組織中某些基因表達(dá)變化的反應(yīng)過程。
　　第四部分
　　實(shí)驗(yàn)

11、二對(duì)大鼠心臟行急性機(jī)械牽張時(shí)左心室PKC活性和MAPK活性的改變及MAPK在心肌細(xì)胞內(nèi)分布的變化
　　目的:研究大鼠離體灌流心臟受急性機(jī)械牽張時(shí),大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的變化以及MAPK在心肌細(xì)胞內(nèi)分布的改變。
　　方法:40只雄性SD大鼠隨機(jī)分成8組,每組5只,分別行單純Langendorff灌流0min,30min,60min,90min(即L0、L30、L60和L90組)以及急性機(jī)械牽張0min,30min,

12、60min,90min(即S0、S30、S60和S90組)。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機(jī)械牽張的心臟模型;利用(γ-32P)ATP體外標(biāo)記磷酸化方法進(jìn)行左室心肌PKC活性測(cè)定;采用Western Blots方法檢測(cè)左室心肌ERK1/2激酶和p38 MAPK的蛋白含量及其磷酸化蛋白含量,以反映其活化水平;對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察左室心肌磷酸化ERK1/2和磷酸化p38 MAPK的細(xì)胞內(nèi)分布情況。

13、>　　結(jié)果:單純行Langendorff灌流各組PKC活性、ERK1/2活性及p38MAPK活性無明顯差異(P>0.05);與相應(yīng)對(duì)照組相比,急性牽張30min后,PKC活性、ERK1/2激酶活性及p38MAPK活性即開始升高,且ERK1/2和p38MAPK發(fā)生核轉(zhuǎn)位,這些變化持續(xù)此后的機(jī)械牽張全過程。
　　結(jié)論:急性機(jī)械牽張可以增加左室PKC、ERK1/2和p38MAPK活性;心臟PKC、ERK1/2和p38MAPK對(duì)急性機(jī)械牽

14、張敏感,且活化的ERK1/2和p38MAPK集中于細(xì)胞核內(nèi)。這提示PKC、MAPK在急性機(jī)械刺激所致的心肌細(xì)胞反應(yīng)中也起重要作用,可能參與了急性機(jī)械刺激所致心肌組織中某些基因表達(dá)變化的反應(yīng)過程。
　　第五部分
　　目的:研究PKC-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在急性機(jī)械牽張致大鼠離體灌流心臟雙孔道鉀通道TREK-1基因表達(dá)改變中的作用。
　　方法:50只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組,即Control組:單純行Langendorff

15、灌流組;Stretch組:急性機(jī)械牽張組;Staurosprine組:急性機(jī)械牽張+staurosprine(PKC抑制劑)組;U0126組:急性機(jī)械牽張+U0126(ERK1/2特異性抑制劑)組;SB202190組:急性機(jī)械牽張+SB202190(p38MAPK特異性抑制劑)組。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機(jī)械牽張的心臟模型;采用Western Blots方法檢測(cè)左室心肌磷酸化ERK1/2激酶和磷酸化p38 M

16、APK蛋白含量;應(yīng)用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測(cè)左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與Control相比,Stretch組左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1基因表達(dá)明顯增加(P<0.01);灌流液中分別加入PKC抑制劑、ERK1/2抑制劑以及p38MAPK抑制劑后, TREK-1的基因表達(dá)與Stretch組比明顯減少。
　　結(jié)論:離體灌流心臟受機(jī)械刺激時(shí)PKC