1、目的:研究二烯丙基二硫(Diallyl disulfide, DADS)誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞差異表達(dá)基因,繪制其差異基因表達(dá)圖譜,尋找 DADS作用人胃癌細(xì)胞的候選相關(guān)基因,為揭示DADS抗胃癌機(jī)制,開拓人胃癌防治的新途經(jīng)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:體外培養(yǎng)人胃癌MGC803細(xì)胞,倒置顯微鏡和光鏡觀察DADS處理MGC803細(xì)胞形態(tài)的改變;MTT比色法檢測(cè)不同濃度DADS對(duì)MGC803細(xì)胞增殖活性的影響;堿性磷酸酶(Alkaline Phos

2、phatase, ALP)活性檢測(cè)法觀察DADS對(duì)MGC803生化代謝的作用;抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization,SSH)、T/A克隆、測(cè)序以及生物信息學(xué)方法分析DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞過程中基因的差異表達(dá)。
　　結(jié)果:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:30mg/L DADS處理MGC803細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比,胞漿豐富,細(xì)胞核變小,染色變淡,核仁數(shù)目明顯減少,散在分布生長,部分細(xì)胞

3、變圓,浮起。
　　MTT顯示:10、20、30、40、50mg/L DADS對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞增殖的抑制率分別為15.2％、26.2%、51.4%、57.3%、70.0%,呈濃度依賴關(guān)系。
　　ALP活性檢測(cè):ALP比活性呈濃度依賴性下降,10、20、30、40、50mg/L處理MGC803細(xì)胞后,其下降率分別為13.7%、25.6%、49.9%、66.5%、72.0%。
　　總RNA提取和mRNA純化:提取的總R

4、NA可見明顯的28S、18S和5S的清晰無拖尾條帶,mRNA為清晰―smear‖帶,無DNA和RNA污染。
　　SSH結(jié)果:連接效率檢測(cè),Rsa I酶消化產(chǎn)物 cDNA與接頭連接效率大于25%;消減有效性實(shí)驗(yàn),未消減樣品在15次循環(huán)時(shí)即可見G3PDH陽性條帶,消減產(chǎn)物在循環(huán)數(shù)達(dá)25-30次才見擴(kuò)增產(chǎn)物,且產(chǎn)物量明顯減少;巢式PCR產(chǎn)物分析顯示,消減組產(chǎn)物片段明顯少于未消減組產(chǎn)物片段,前者可見清浙的條帶,后者呈瀑布狀;差異消減cDN

5、A文庫的建立及鑒定,T/A克隆后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌后,隨機(jī)挑取80個(gè)白色克隆,提取質(zhì)粒DNA,EcoRⅠ酶切、PCR分析發(fā)現(xiàn)60個(gè)克隆具有大小約100~1000 bp的插入片段。
　　測(cè)序及生物信息學(xué)分析:測(cè)序共獲得34個(gè)序列完整的克隆。GenBank同源性比較,篩選出DADS誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞前后差異表達(dá)的12個(gè)基因,序列同源性為98%-100%。正向消減文庫中,上調(diào)表達(dá)基因有細(xì)胞周期相關(guān)基因 p21WAF1、ENO1,抗氧化

6、相關(guān)基因FTH1、PRDXⅡ,細(xì)胞骨架相關(guān)基因PFN1,細(xì)胞代謝相關(guān)基因MDH2;反向消減文庫中,下調(diào)表達(dá)基因?yàn)榧?xì)胞周期相關(guān)基因PTOV1,細(xì)胞骨架及細(xì)胞遷移相關(guān)基因 ANXA2、RAC1、WDR1,細(xì)胞代謝相關(guān)基因ALDOA以及癌基因EWSR1。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞差異表達(dá)基因的正、反向消減 cDNA文庫。
　　2.初步篩選了12個(gè)DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞差異表達(dá)基因,上調(diào)的