1、本研究利用體外培養(yǎng)的新生牛單層肝細胞，采用熒光定量PCR方法檢測不同濃度胰高血糖素、瘦蛋白對肝糖異生關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)mRNA表達的影響。首先，根據(jù)GenBank上發(fā)表的牛PEPCK序列，設計一對外圍引物、一對內圍引物、一個MGb熒光探針；然后應用外圍引物進行常規(guī)RT-PCR，成功擴增出PEPCK目的片段，大小為337bp，并將其克隆到pMD-18

2、T載體上測序。其測序結果與GenBank上的序列進行同源性比較，與發(fā)表的基因序列同源性為99％，只有一個堿基發(fā)生突變，且該突變未發(fā)生在探針范圍內，表明基因克隆結果正確可用于陽性質粒標準品的制備。隨后利用該質粒作為標準品進行熒光定量PCR，繪制出標準曲線，成功建立了檢測該基因的方法。通過實驗證明該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強，可以用于檢測PEPCK基因的表達。 本實驗在參考國內外有關文獻的基礎上，采用傳統(tǒng)的酶消化法和機械碾磨法成功地進行

3、了新生牛體外肝細胞的原代培養(yǎng)。通過在原代培養(yǎng)的新生牛肝細胞中分別添加不同濃度的胰高血糖素、瘦蛋白檢測磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA的變動規(guī)律。培養(yǎng)液中胰高血糖素濃度分別為(0、1、10、100和1000nmol/L)，瘦蛋白濃度分別為(0、2.5、5.0、10和50ng/mL)；培養(yǎng)12h后，提取總RNA，進行反轉錄；用反轉錄產物為模板，通過已經(jīng)建立的熒光定量PCR方法檢測肝細胞PEPCKmRNA表達水平。結果顯示：隨著胰高血糖素濃度的