1、第一部分：鼻息肉組織Th細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定 背景 鼻息肉是臨床常見(jiàn)病，手術(shù)后極易復(fù)發(fā)，尚無(wú)根治性手段。尚無(wú)確定的臨床病理分型和圍手術(shù)期綜合治療原則。鼻息肉的發(fā)生機(jī)制也不確定，關(guān)于鼻息肉的發(fā)生機(jī)制，主要存在兩種學(xué)說(shuō)之爭(zhēng)，即金黃色葡萄球菌超抗原學(xué)說(shuō)和真菌變態(tài)反應(yīng)學(xué)說(shuō)。細(xì)菌、病毒、真菌及變應(yīng)原等可能作為最初的觸發(fā)因素引起鼻腔外側(cè)壁的炎癥而發(fā)展形成鼻息肉。鼻息肉組織含大量炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞可能在鼻息肉發(fā)

2、病中起重要作用。 T 淋巴細(xì)胞按表面分子不同分為CD4+T淋巴細(xì)胞(又稱(chēng)輔助T淋巴細(xì)胞，Thelp cell，Th細(xì)胞)和CD8+T淋巴細(xì)胞(又稱(chēng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞，CTL，或殺傷性T細(xì)胞，TC)。Th細(xì)胞按產(chǎn)生細(xì)胞因子和功能的不同又分為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。功能不同的輔助T淋巴細(xì)胞(Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞)存在的證據(jù)對(duì)基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)產(chǎn)生了重大影響。Th1和Th2細(xì)胞在免疫應(yīng)答的平衡中起關(guān)鍵性作用。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生干擾素-γ

3、(IFN-γ)，促進(jìn)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗感染機(jī)制；Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生白介素-4(IL-4)，促進(jìn)體液免疫，在變態(tài)反應(yīng)中起作用。這些基礎(chǔ)免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)結(jié)合鼻息肉的發(fā)生機(jī)制，可以推測(cè)在鼻息肉組織中，Th1細(xì)胞可能與金葡菌感染引起的免疫應(yīng)答有關(guān)，Th2細(xì)胞可能與真菌及變應(yīng)原引起的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。 關(guān)于鼻息肉組織T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的研究已有報(bào)道，但對(duì)Th細(xì)胞亞群的深入研究尚少，尚無(wú)關(guān)于合并與不合并AR的鼻息肉在Th細(xì)胞亞群方面的研究報(bào)

4、道。 本實(shí)驗(yàn)以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定合并與不合并AR的鼻息肉組織的Th1和Th2細(xì)胞百分率，以明確不同類(lèi)型鼻息肉組織在Th細(xì)胞亞群和免疫應(yīng)答類(lèi)型方面的差異，評(píng)價(jià)金葡菌感染和真菌變態(tài)反應(yīng)因素在不同類(lèi)型鼻息肉病因?qū)W中的作用，評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌超抗原學(xué)說(shuō)和真菌變態(tài)反應(yīng)學(xué)說(shuō)對(duì)不同類(lèi)型鼻息肉發(fā)生形成的意義，指導(dǎo)鼻息肉分型和綜合治療。 方法 32例鼻息肉病例分為兩組，其中包括不合并變應(yīng)性鼻炎(AR)的鼻息肉組16例，合并變應(yīng)性鼻炎

5、的鼻息肉組16例，依據(jù)變應(yīng)性鼻炎病史和臨床表現(xiàn)，以及變應(yīng)原點(diǎn)刺試驗(yàn)區(qū)分不合并AR的鼻息肉與合并AR的鼻息肉。新鮮手術(shù)標(biāo)本制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀測(cè)定Th1和Th2細(xì)胞百分率，在CD4+細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ的為T(mén)h1細(xì)胞，產(chǎn)生IL-4的為T(mén)h2細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的為T(mén)h0細(xì)胞。測(cè)得的Th細(xì)胞百分率用x±s表示，用SPSS for WindowsVer.11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)兩鼻息肉組的Th1、Th2細(xì)胞百

6、分率進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 結(jié)果 息肉組織含有大量Th細(xì)胞并且以Th1細(xì)胞為主；不合并AR的鼻息肉組Th1和Th2細(xì)胞平均百分率分別為46.28％±14.95％和0.63％±0.31％；合并AR的鼻息肉組Th1和Th2細(xì)胞平均百分率分別為38.25％±9.16％和7.34％±2.54％；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示不合并AR的鼻息肉組與合并AR的鼻息肉組相比Th1細(xì)胞平均百分率無(wú)顯著差異，t=1.83，P>0.05；合并

7、AR的鼻息肉組Th2細(xì)胞平均百分率顯著高于不合并AR的鼻息肉組，t=10.48，P<0.01。 結(jié)論鼻息肉組織以Th1細(xì)胞亞群為主；合并AR的鼻息肉Th2細(xì)胞數(shù)顯著高于不合并AR的鼻息肉，合并與不合并AR的鼻息肉在Th細(xì)胞亞群和免疫應(yīng)答類(lèi)型方面存在差異；金葡菌感染可能在不合并AR的鼻息肉的發(fā)生形成中起關(guān)鍵作用，金葡菌感染和真菌變態(tài)反應(yīng)因素可能在合并AR的鼻息肉的發(fā)生形成中均有一定作用。 第二部分：鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸

8、潤(rùn)與Th2細(xì)胞的關(guān)系 背景 鼻息肉組織含大量炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞可能在鼻息肉的發(fā)生和形成中起重要作用。在過(guò)去的二十年中，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞在某些病理生理過(guò)程中的作用有了逐步認(rèn)識(shí)。嗜酸性粒細(xì)胞的前體細(xì)胞從骨髓釋放進(jìn)入血液循環(huán)，在化學(xué)趨化性因子的作用下進(jìn)入作用部位，嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)育和成熟可發(fā)生在外周炎癥部位?；罨人嵝粤＜?xì)胞在哮喘、寄生蟲(chóng)病、肉芽腫病變、纖維化、許多惡性腫瘤及鼻腔鼻竇疾病中起作用。在變應(yīng)性

9、鼻炎(AR)，嗜酸性粒細(xì)胞從外周血浸潤(rùn)到鼻腔粘膜組織后主要參與遲發(fā)相反應(yīng)，Th-2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可促使嗜酸性粒細(xì)胞的集聚和活化。在Th-2類(lèi)細(xì)胞因子中，IL-4起中心性作用，它可促使IgE的合成，通過(guò)上調(diào)粘附分子的表達(dá)引起嗜酸性粒細(xì)胞集聚，增加粘液的生成。嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒中含有許多細(xì)胞毒性蛋白包括嗜酸性細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)，主要堿性蛋白(MBP)，嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶(EPO)和嗜酸性細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素。嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性

10、作用可能在針對(duì)變應(yīng)原和對(duì)抗真菌的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。 關(guān)于鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的研究已有報(bào)道，但對(duì)合并與不合并AR的鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度差異的研究尚少，尚無(wú)鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與Th2細(xì)胞關(guān)系的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)合并與不合并AR的鼻息肉組織石蠟標(biāo)本HE切片進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，并分析嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)與與Th2細(xì)胞百分率的相關(guān)性，以明確合并與不合并AR的鼻息肉組織在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量上的差別，明確嗜酸性粒

11、細(xì)胞浸潤(rùn)與Th2細(xì)胞的關(guān)系，探討鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的發(fā)生機(jī)制。 方法 對(duì)兩組鼻息肉病例常規(guī)病理標(biāo)本HE切片進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度的定量，計(jì)數(shù)每高倍視野平均嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS for Windows Ver.11.5軟件對(duì)兩鼻息肉組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并對(duì)全部病例的Th2細(xì)胞百分率與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)論 合并A

12、R的鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于不合并AR的鼻息肉組織；鼻息肉組織的Th2細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)相關(guān)，Th2細(xì)胞可能通過(guò)釋放Th2細(xì)胞因子促使鼻息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。 第三部分：鼻息肉組織Th細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) 背景 鼻息肉的發(fā)生機(jī)制尚不確定，關(guān)于鼻息肉的發(fā)生機(jī)制，主要存在兩種學(xué)說(shuō)之爭(zhēng)，即金黃色葡萄球菌超抗原學(xué)說(shuō)和真菌變態(tài)反應(yīng)學(xué)說(shuō)。細(xì)菌、病毒、真菌及變應(yīng)原等可能作為最初的觸發(fā)因素引起鼻腔外側(cè)壁的炎癥而

13、發(fā)展形成鼻息肉。 幼稚CD4細(xì)胞分化為成熟的Th細(xì)胞亞群是機(jī)體防御機(jī)制和免疫介導(dǎo)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵過(guò)程，Th細(xì)胞分化決定免疫應(yīng)答的性質(zhì)。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF，功能是促進(jìn)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染機(jī)制；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13，功能是促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，在變態(tài)反應(yīng)和機(jī)體抗寄生蟲(chóng)免疫中發(fā)揮作用。局部環(huán)境中的細(xì)胞因子以及細(xì)胞

14、內(nèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在Th分化中起主要作用。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)合并與不合并AR的鼻息肉及對(duì)照下鼻甲液氮冷凍標(biāo)本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定Th1細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th2細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達(dá)，以進(jìn)一步明確合并與不合并AR的鼻息肉組織在Th細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答類(lèi)型方面的差異，評(píng)價(jià)金葡菌感染和真菌變態(tài)反應(yīng)因素在不同類(lèi)型鼻息肉病因?qū)W中的作用，評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌超抗原學(xué)說(shuō)和真菌變態(tài)反應(yīng)學(xué)說(shuō)對(duì)鼻息肉不同類(lèi)型發(fā)生形成的

15、意義，指導(dǎo)鼻息肉分型和綜合治療。 方法 標(biāo)本為液氮冷凍標(biāo)本，包括對(duì)照下鼻甲組織10例，不合并AR的鼻息肉16例及合并AR的鼻息肉16例。根據(jù)試劑使用說(shuō)明用TRIzol Reagent從液氮冷凍下鼻甲和鼻息肉組織提取總RNA；DNA 酶Ⅰ去除基因組 DNA；使用逆轉(zhuǎn)錄酶及2μg提取的總RNA合成cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR在30μl容積中進(jìn)行：其中包含27.5μl TaqMan Universal PCR Master M

16、ix，0.6 μl正向引物，0.6μl反向引物，0.3μl探針和1μl模板(100ng)。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min預(yù)變性，然后(95℃變性20s，60℃的退火/延伸20s)×60循環(huán)。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因表達(dá)做內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀BIO RADIcycler 5中進(jìn)行，用熒光定量PCR分析軟件Icycler version3.1.7050進(jìn)行分析。 結(jié)論 鼻息肉組織GATA-