1、目的： 研究RSV感染后TLR3的表達(dá)變化及其介導(dǎo)的下游信號分子改變，探討TLR3介導(dǎo)RSV感染所致炎癥免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。用MT預(yù)先給藥進(jìn)行干預(yù)，通過比較TLR3的表達(dá)變化及其介導(dǎo)的下游信號分子改變，研究MT作用的機(jī)制；同時觀察MT膜和核受體的表達(dá)，明確MT是通過與何種受體的結(jié)合而發(fā)揮作用。 方法： 1.TLR3介導(dǎo)RSV感染所致炎癥免疫反應(yīng)的體外實驗用RSV感染體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，收集不同感染時間

2、點(設(shè)RSV感染0，l，4，8，16，24小時組)的細(xì)胞和培養(yǎng)上清，用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR.)檢測TLR3、MyD88、TNF-a和iNOS mRNA的表達(dá)變化，用Westernblot檢測TLR3蛋白和核內(nèi)活性NF-kBp65蛋白的表達(dá)變化，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELJSA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a蛋白變化。 2.TLR3介導(dǎo)RSV感染所致炎癥免疫反應(yīng)的體內(nèi)實驗用RSV滴鼻感染昆明小鼠，收集不同感染時間點(

3、設(shè)RSV感染0，1，4，8，16，24小時組或48，72，96小時組)的小鼠血清和肺，用半定量RT-PCR檢測肺TLR3、MyD88、TNF-a和iNOS mRNA的表達(dá)變化，用Western blot檢測TLR3蛋白和核內(nèi)活性NF.KBp65蛋白的表達(dá)變化，用ELISA檢測小鼠血清中TNF-a表達(dá)變化。 3.MT干預(yù)的體外實驗MT分10-7M、lO-6M、10-5M三個濃度組，預(yù)先處理RAW264.7細(xì)胞，分別收集上述不同感染

4、時間點的細(xì)胞和培養(yǎng)上清，用半定量RT-PCR檢測TLR3、MyD88、TNF-a和iNOS mRNA的表達(dá)變化，并對MT膜受體MT1和MT2以及核受體RORa進(jìn)行mRNA測定。用Western blot檢測TLR3蛋白和核內(nèi)活性NF-kBp65蛋白的表達(dá)變化，用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a蛋白變化。 4.MT干預(yù)的體內(nèi)實驗MT分5mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1三個劑量組，預(yù)先灌胃給藥，連

5、續(xù)七天。分別收集上述不同感染時間點的小鼠血清和肺，用半定量RT-PCR檢測肺TLR3、MyD88、TNF-a和iNOS mRNA的表達(dá)變化，并對MT膜受體MT1、MT2以及核受體RORa進(jìn)行mRNA測定。用Western blot檢測TLR3蛋白和核內(nèi)活性NF-KBp65蛋白的表達(dá)變化，用ELISA方法檢測小鼠血清中TNF-a表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.TLR3介導(dǎo)RSV感染所致炎癥免疫反應(yīng)的體外實驗結(jié)果RSV感染4 h后即

6、上調(diào)RAW264.7細(xì)胞TLR3、TNF-a和iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；RSV感染8h后即可誘導(dǎo)活化TLR3蛋白和核內(nèi)活性NF-kB蛋白的表達(dá)，并升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a的分泌量。各指標(biāo)的變化與對照組相比差異均有顯著性，并且隨著RSV感染時間的延長而表達(dá)量增加。但MyD88 mRNA表達(dá)未見明顯變化。 2.TLR3介導(dǎo)RSV感染所致炎癥免疫反應(yīng)的體內(nèi)實驗結(jié)果RSV感染小鼠4 h后即能上調(diào)肺TLR3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)活化核

7、內(nèi)NF-kB蛋白的表達(dá)；RSV感染48 h后上調(diào)TNF-a mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；感染72 h上調(diào)iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。并于RSV感染48 h后觀察到小鼠血清中TNF-a的分泌量也增加。各指標(biāo)的變化較對照組差異均有顯著性。但在感染24 h內(nèi)未檢測到肺組織中TLR3蛋白的表達(dá)；而MyD88 mRNA表達(dá)也未見明顯變化。 3.MT干預(yù)的體外實驗結(jié)果MT三個濃度組(10-7M、10-6M、10-5M)在RSV感染RAW264.7

8、細(xì)胞后4 h，即可下調(diào)RSV誘導(dǎo)的TNF-a mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，其下調(diào)作用隨著MT濃度的增加更加明顯。而對于iNOS mRNA，10-7M的MT未能起到下調(diào)作用，10-6M和10-5M的MT則從RSV感染4 h開始就能下調(diào)iNOS表達(dá)，10-5M的作用更明顯。結(jié)果還顯示：MT在10-7M濃度時未能起到下調(diào)NF-KB的作用，10-6M和10-5M濃度MT則從RSV感染4 h開始就能下調(diào)其表達(dá)，10-5M的MT作用更明顯。但各濃度組的MT

9、對TLR3mRNA和蛋白的表達(dá)均沒有明顯的下調(diào)作用，而對MyD88 mRNA表達(dá)也未見明顯影響。對MT受體的檢測結(jié)果顯示，RAW細(xì)胞均未檢測到膜受體MT1、MT2的表達(dá)，而核受體RORa在各組均有表達(dá)且均勻一致。MT在10-7M濃度時未能起到下調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-a蛋白的作用，10-6M和10-5M濃度MT則從RSV感染8 h開始就能下調(diào)其表達(dá)，其中10-5M的MT作用更明顯。 4.MT干預(yù)的體內(nèi)實驗結(jié)果MT在10 mg·kg

10、-1和20 mg·kg-1劑量組時，均能在RSV感染72 h后下調(diào)RSV誘導(dǎo)的肺組織TNF-a和iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。20 mg·kg-1劑量的MT組在RSV感染4 h而10 mg.kg-1劑量MT在RSV感染8 h，即可下調(diào)NF-KB的活性表達(dá)。 MT在10 mg.kg-1。劑量時，從RSV感染的48 h開始可降低血清中TNF-a的產(chǎn)生，其中20 mg·kg-1劑量的下調(diào)作用更明顯。但各劑量組的MT對TLR3、MyD8

11、8和RORa的表達(dá)均不影響。我們也未檢測到MT1、MT2的表達(dá)。 結(jié)論： 1.RSV感染可上調(diào)TLR3、TNF-a和iNOS mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)活化TLR3蛋白和核內(nèi)NF-kB的表達(dá)，升高細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠血清中TNF-a的分泌量。表明病毒誘導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)與TLR3活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，TLR3可能參與了RSV誘導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，推測是通過MyD88非依賴或部分依賴途徑而活化NF-kB。 2.MT在一定濃度

12、和劑量范圍內(nèi)，能降低RSV誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和肺的核內(nèi)活性NF-kB的表達(dá)，下調(diào)RSV誘導(dǎo)的TNF-a和iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，降低細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠血清中TNF-a的分泌量。但MT對TLR3 mRNA和蛋白，MyD88和RORa的mRNA表達(dá)均無明顯影響。 3.MT抑制RSV誘導(dǎo)的NF-KB活化、下調(diào)TNF-a和iNOS的表達(dá)隨著藥物劑量(或濃度)的增加及感染時間的延長而更加明顯。 4.MT可能通過與其核