1、目的： 1.預測和篩選EBV-LMP2多表位肽：預測EB病毒(EBV)潛伏膜蛋白2(LMP2)的CTL和Th細胞表位，選擇評分較高的CTL和Th表位，并結合本實驗室預測的EBV-LMP2 B細胞表位[1]，獲得EBV-LMP2多表位肽序列。 2.EBV-LMP2多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表達和純化：構建含EBV-LMP2多表位肽的原核重組質粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽，經IPTG誘導后用Wester

2、n blot進行特異性鑒定。采用Ni-NTA樹脂親和層析法純化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽。同時純化pET32a(+)表達的His蛋白用于動物免疫和ELISA檢測的對照研究。 3.利用小鼠檢測EBV-LMP2多表位肽的免疫原性：將純化的EBV-LMP2多表位肽和His蛋白分別免疫BALB/c小鼠，隔周免疫，共3次。采用ELISA方法分析免疫后小鼠血清IgG及陰道分泌物sIgA水平及維持時間，并采用EBV抗原(B95-8細胞制

3、備)作為陽性對照。同時，在末次免疫后1w無菌取小鼠脾細胞用LDH釋放法進行CTL殺傷活性分析，以檢測EBV-LMP2多表位肽免疫小鼠后誘導的特異性細胞免疫效應。本研究初步分析了EBV-LMP2多表位肽免疫原性，為EBV感染相關疾病的表位疫苗設計及研制相關診斷試劑奠定了基礎。 方法： 1.以EBV標準株(B95-8細胞)LMP2的完整氨基酸序列(497aa)為基礎，應用在線預測網(wǎng)站SYFPEITHI(http：//www.

4、syfpeithi.de/)，預測EBV-LMP2的H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501等限制性表位，尤其是HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd重疊的區(qū)域，選擇含CTL、Th表位富集的肽段。結合本實驗室已經報道的EBV-LMP2 B細胞表位[1]，選擇B細胞表位及CTL、Th細胞表位富集的肽段作為多表位肽的候選序列。

5、 2.將EBV-LMP2多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并將其插入原核質粒pET32a(+)，構建含有His標簽的重組質粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。經IPTG誘導表達后的融合蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳，并用Western blot鑒定其免疫原性，用Ni-NTA樹脂親和層析法純化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽及His蛋白。 3.選擇6～8周齡雌性BALB/c小鼠，分3組，即EBV-LMP2多

6、表位肽組、His蛋白組及PBS組，每組9只。將純化后的融合蛋白EBV LMP2多表位肽及His蛋白與佐劑等體積混勻后按照50μg/只劑量分別免疫小鼠，采用背部皮下多點注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后1w斷尾取血并收集陰道分泌物，采用ELISA法檢測血清中特異性IgG和陰道分泌物中特異性sIgA水平。同時，于術次免疫后1w，每組隨機取3只小鼠，無菌取脾臟，制備脾細胞進行CTL細胞特異性殺傷活性檢測，采用乳酸脫氫酶LDH釋放法檢

7、測其特異性細胞免疫效應。其余小鼠持續(xù)檢測其特異性血清IgG和陰道分泌物特異性sIgA的持續(xù)水平直至第7w。 結果： 1.從SYFPEITHI網(wǎng)站預測到的候選CTL和Th表位中選擇出19條評分較高的肽段，結合本實驗室已經預測的EBV-LMP2 B細胞表位[1]，選擇CTL和Th細胞富集的肽段，即EBV-LMP2195-232和EBV-LMP2419-435肽段，將兩段序列串聯(lián)，即得到EBV-LMP2多表位肽序列。

8、2.酶切鑒定和核苷酸測序結果表明，成功構建了含有EBV-LMP2多表位肽的原核重組質粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。SDS-PAGE分析，在37℃，1.0mM IPTG作用下誘導6hr能很好地表達目的蛋白，相對分子質量(Mr)約為27kDa，與預期Mr大小吻合；蛋白表達量約占細菌總蛋白量的23％。Western Blot結果顯示，以HRP標記的小鼠抗His-IgG(H+L)作為一抗，則可見單一明顯條帶，與SDS-PAGE

9、中位置吻合。用Ni-NTA樹脂親和層析法分別純化得到表位融合蛋白EBV-LMP2多表位肽和pET32a(+)所表達的His蛋白。 3.BALB/c小鼠經融合蛋白EBV-LMP2多表位肽免疫后，可獲得高效價的血清特異性IgG。血清抗體效價隨免疫次數(shù)增加而升高，自第1w開始升高，可持續(xù)至第7w。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被并將血清按1：100稀釋，檢測第7w小鼠IgG抗體水平：EBV-LMP2多表位肽組A值為(1.17

10、8±0.130)，His蛋白組及PBS組分別為(0.468±0.121)，(0.016±0.008)； EBV-LMP2多表位肽組分別與His蛋白組及PBS組相比，均有顯著性差異(P<0.05)； His蛋白組與PBS相比也有顯著性差異(P<0.05)。 4.三組小鼠陰道分泌物特異性sIgA自第3w開始升高，至第5w達到高峰，然后下降。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被檢測第5w小鼠sIgA抗體水平：EBV-LMP2多表

11、位肽組A值為(0.754±0.064)，His蛋白組和PBS組分別為(0.455±0.038)，(0.171±0.018)； EBV-LMP2多表位肽組分別與His蛋白組及PBS組相比，均有顯著性差異(P<0.05)； His蛋白組與PBS相比也有顯著性差異(P<0.05)。 5.免疫小鼠CTL特異性的殺傷活性結果顯示，隨著效靶比的增加，EBV-LMP2多表位肽組的特異性殺傷率逐漸升高。效靶比為5：1、10：1、25：1時，EB

12、V-LMP2多表位肽組的殺傷率分別為(12.52±2.59)％、(21.80±1.080)％和(23.68±3.74)％，His蛋白組和PBS組相應效靶比殺傷率分別為(3.72±1.18)％，(4.35±0.85)％，(7.15±2.09)％和(2.29±1.05)％，(4.12±0.42)％，(4.93±0.10)％。經統(tǒng)計分析，效靶比為5：1，10：1和25：1時，EBV-LMP2多表位肽組與His蛋白組和PBS組相比均有顯著性差差

13、異P<0.05)，而His蛋白組和PBS組相比則無顯著性差異(P>0.05)。 結論： 1.預測并篩選了19個可能的EBV-LMP2的CTL表位和Th表位，結合本實驗室已經預測的B細胞表位[1]，確定了EBV-LMP2多表位肽序列。 2.通過分子克隆技術，成功構建了含EBV-LMP2多表位肽的重組質粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽；在原核表達系統(tǒng)表達了多表位蛋白EBV-LMP2多表位肽；通過親和層析

14、法得到了純化的EBV-LMP2多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫BALB/c小鼠的血清學檢測結果表明，EB V-LMP2多表位肽能刺激機體產生全身及局部的特異性抗體：血清特異性抗體IgG效價隨免疫次數(shù)增加而升高，自第1w開始升高，可持續(xù)至第7w；陰道分泌物特異性sIgA自第3w開始升高，到第5w達高峰，然后下降。 4.乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CTL特異性殺傷結果顯示，EBV-LMP2多表位肽可以刺激機體產