1、Epstein-Barr(EB)病毒與多種人類的惡性腫瘤相關，鼻咽癌是其中之一，在我國南方一些省(自治區(qū))發(fā)病率可高達10～50/10萬/年，成為我國重點防治的十大腫瘤之一。雖然放療及放療聯合化療對很多病例有效，但仍有大約30％的病人難以控制。EBV在癌細胞中的存在為以CTL為基礎進行鼻咽癌的免疫治療提供了良好的靶位，成為傳統治療方法的有益補充。鼻咽癌的腫瘤細胞EBV處于Ⅱ型隱性感染狀態(tài)，表達EBNAl,LMPl和LMP2蛋白。LMP2

2、在腫瘤細胞中能穩(wěn)定表達，無致癌性，具有潛在的HLA限制的細胞激活表位，能良好的誘導CTL發(fā)揮作用，成為公認的治療NPC較理想的靶抗原。
　　 本課題組在科室長期從事鼻咽癌的早期診斷及疫苗研究工作的基礎上，致力于鼻咽癌的治療性疫苗的研究。左建民等成功構建了攜帶EBV-LMP2基因的非復制5型重組腺病毒(rAd-LMP2)，該病毒可以在細胞內以內源蛋白的方式表達LMP2蛋白。王湛等對其進行了免疫效果研究，研究表明免疫恒河猴后能有效的

3、誘導特異性CTL反應。腺病毒載體宿主范圍廣泛，對分裂期細胞、靜止或終末分化細胞都有較高的轉導效率，可在細胞內短期高水平表達目的基因，但腺病毒載體具有極高的免疫原性，免疫劑量及免疫次數增加都會顯著增加腺病毒中和抗體的滴度，影響了目的基因的有效運輸，對希望達到高效的免疫治療效果會產生一定的影響。研究表明，用DNA疫苗或者一種載體疫苗初免后，用另一種載體疫苗加強免疫動物，與單一的疫苗免疫動物相比，能誘導更強的免疫應答。因此，我們擬構建另兩種疫

4、苗，DNA疫苗和重組腺相關病毒疫苗。DNA疫苗具有易于構建和改造、成本低廉、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，通過在體內表達目的抗原而引起特異性免疫反應，可以激發(fā)細胞免疫和體液免疫，尤其能更好的誘導特異性CTL。重組腺相關病毒(rAAV)載體宿主范圍廣，安全性好、物理性質穩(wěn)定，具有極低的免疫原性和較長時期的基因表達能力，成為很有前景的用于疫苗的載體。鑒于以上背景，本研究在課題組以往從事的rAd-LMP2研究的基礎上，制備DNA疫苗pVR-LMP2，重組

5、腺相關病毒疫苗rAAV2/1-LMP2，幾種疫苗聯合應用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，以期達到單一疫苗難以達到的效果。
　　 構建了DNA疫苗pVR-LMP2，酶切及測序結果表明LMP2基因正確插入pVR質粒載體中，間接免疫熒光實驗及Western Blot法檢測確認了LMP2在293細胞中能有效表達。
　　 構建了重組AAV表達質粒pSNAV-LMP2，并建立了rAAV2/1-LMP2的生產細胞株BHK-LMP2，最終制備及純化了

6、AAV疫苗rAAV2/1-LMP2。電鏡觀察及SDS-PAGE分析顯示我們得到了高純度的重組病毒rAAV2/1-LMP2，感染性檢測表明rAAV2/1-LMP2能感染293細胞并能有效表達LMP2蛋白。
　　 將制備及純化的pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及本課題組已經制備好的rAd-LMP2，單獨及幾種聯合免疫BalB/C小鼠，2周間隔，免疫三次，末次免疫后一周取脾淋巴細胞，IFN-γELISPOT檢測特異CTL水平

7、。結果表明pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及rAd-LMP2單獨免疫，組平均數分別為50個斑點形成細胞/106淋巴細胞、110個斑點形成細胞/106淋巴細胞、368個斑點形成細胞/106淋巴細胞，明顯低于聯合免疫組。在聯合免疫組中，pVR-LMP2免疫兩次，rAd-LMP2最后加強一次，組平均數為928個斑點形成細胞/106淋巴細胞，高于pVR-LMP2免疫一次，rAd-LMP2加強免疫兩次組(組平均數為770個斑點形成細胞/

8、106淋巴細胞)，可能是rAd-LMP2免疫一次后產生的腺病毒中和抗體封閉了再次的腺病毒載體，導致第二次的rAd-LMP2免疫不能很好的發(fā)揮作用。pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2和rAd-LMP2各免疫一次組的免疫效果最好，組平均數為1024個斑點形成細胞/106淋巴細胞，其中最高一只小鼠達到了1202個斑點形成細胞/106淋巴細胞。
　　 總之，我們成功構建了DNA疫苗pVR-LMP2和重組腺相關病毒疫苗rAAV2/