1、目的： 尿失禁是一種排尿自禁功能障礙性疾病，國際尿控協(xié)會(huì)(Intenlational Continence Society，ICS)定義為不能由意志控制的流尿現(xiàn)象，隨著人口老齡化進(jìn)程的加重，其發(fā)病率越來越高，UI雖然不危及患者的生命，但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。多數(shù)統(tǒng)計(jì)認(rèn)為男性外傷或前列腺術(shù)后尿失禁的發(fā)病率為3％-40％，治療上非常棘手。尿道固有括約肌結(jié)構(gòu)及功能缺陷(intrinsic sphincter deficiency，I

2、SD)是導(dǎo)致UI的關(guān)鍵機(jī)制之一，雖然正常機(jī)體存在成肌作用，但尿道括約肌的再生能力有限，所以患者存在明顯的成肌功能障礙。男性外傷或前列腺術(shù)后UI的治療方法眾多，包括非手術(shù)治療和手術(shù)治療，非手術(shù)治療包括藥物治療、盆底肌鍛煉、生物反饋、電刺激、行為治療等，療效較差，外科手術(shù)治療方法有：人工尿道括約肌植入術(shù)、球部尿道海綿體懸吊術(shù)、尿道粘膜下注射等。類似女性尿失禁，其中早期尿道粘膜下注射填充物質(zhì)是治療由ISD導(dǎo)致UI的有效方法之一，由于注射治療具

3、有安全、簡便、微創(chuàng)的特點(diǎn)而逐漸受到醫(yī)生和患者的重視和歡迎。目前常用的注射材料有特氟隆、膠原、自體脂肪、硅顆粒等，雖然近期療效好，但遠(yuǎn)期效果不佳。理想的注射材料應(yīng)該是安全、高效、持久、無免疫原性、不發(fā)生遷移。 隨著細(xì)胞組織工程的發(fā)展，人們利用細(xì)胞具有多潛能再生能力和可塑性的特點(diǎn)通過注射治療恢復(fù)、替代和修復(fù)受損組織和器官，相關(guān)的基礎(chǔ)研究已經(jīng)廣泛地開展。人們對(duì)骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌內(nèi)包含的成肌細(xì)胞(myoblast)，

4、通常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，肌肉損傷時(shí)能夠分裂增殖，而肌源細(xì)胞(muscle derived cell，MDC)的分裂能力更強(qiáng)，它含有衛(wèi)星細(xì)胞(satellite cell)，后者具有干細(xì)胞的特征。類似的研究如治療心肌梗塞，骨骼肌MDC心肌內(nèi)注射后能長期存活并可改善心臟功能，而下尿路功能障礙，尤其是尿失禁病變位置表淺，易于注射，與其它材料相比，MDC是自身組織材料，不存在組織相容性問題，亦不怕注射物的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠尿道括約肌損傷尿

5、失禁動(dòng)物模型，肌源細(xì)胞自體移植，觀察對(duì)括約肌損傷尿失禁的治療作用，為MDC自體移植治療尿失禁在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法： 1．大鼠MDC的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染： 取成年健康SD大鼠，分離肌肉細(xì)胞后，膠原酶、分解酶及胰蛋白酶消化細(xì)胞，用鼠尾膠原鋪被培養(yǎng)瓶，采用差速貼壁技術(shù)，按細(xì)胞貼壁的快慢將肌細(xì)胞分為PP1-PP6。培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1h，貼壁的細(xì)胞為PP1；未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h

6、，貼壁的細(xì)胞為PP2;未貼壁的細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18h，貼壁的細(xì)胞為PP3；未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h，貼壁的細(xì)胞為PP4)此過程重復(fù)(間隔24h)至PP6。貼壁細(xì)胞原代培養(yǎng)后傳代培養(yǎng)，α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白對(duì)PP1-PP6細(xì)胞及分化后的肌管進(jìn)行鑒定。用熒光染料Hoechst33258標(biāo)記第二代PP5、PP6細(xì)胞。 2．用燒灼尿道中段括約肌的方法建立大鼠尿失禁動(dòng)物模型，通過尿道置管尿動(dòng)力學(xué)檢查和噴嚏實(shí)驗(yàn)檢

7、驗(yàn)動(dòng)物模型的陽性率。用成功建立尿失禁的動(dòng)物分組，注射組12只，照上述方法制取MDC，并轉(zhuǎn)染Hoechst33258作標(biāo)記，尿道注射；假注射組12只，DMEM培養(yǎng)基尿道注射；正常大鼠對(duì)照組6只，剖腹暴露尿道而不注射物質(zhì)。注射組和假注射組在1、7、14、30天每組各取3只大鼠處死，制作尿道組織切片，觀察注射細(xì)胞的生長情況和組織變化；三組于注射后1周、2周各取3只大鼠行尿動(dòng)力學(xué)檢查，從形態(tài)和功能上評(píng)估尿失禁的治療效果。 結(jié)果：

8、 1．通過差速貼壁技術(shù)獲得肌源細(xì)胞，PP1、PP2細(xì)胞貼壁迅速，數(shù)量多，PP3以后數(shù)量減少，PP5、PP6數(shù)量更少，原代培養(yǎng)PP6細(xì)胞48小時(shí)后仍為圓形，72小時(shí)后開始貼壁，細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮?，體積增大，傳代培養(yǎng)3代內(nèi)細(xì)胞分布均勻，分裂旺盛，7代后細(xì)胞生長緩慢，變形裂解開始脫壁。分化培養(yǎng)后可見明顯的肌管形成。 2．免疫組織化學(xué)鑒定：α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白染色肌源細(xì)胞呈陽性，且PP1-PP6陽性率逐漸增高，在肌管為強(qiáng)陽性。這表明PP1、PP2

9、主要是成纖維細(xì)胞，PP3以后肌源細(xì)胞含量逐漸增高，PP5、PP6為主要肌源細(xì)胞，并具有干細(xì)胞的特征。 3．MDC的標(biāo)記：熒光顯微鏡下，Hoeehst33258染色的活細(xì)胞核呈藍(lán)色，淺染，圓形，邊界規(guī)則整齊，而凋亡細(xì)胞核內(nèi)DNA濃聚，核碎裂，表現(xiàn)為體積明顯縮小的深染核形態(tài)。 4．尿失禁動(dòng)物模型：燒灼尿道中段括約肌后，尿道置管尿動(dòng)力學(xué)檢查漏尿點(diǎn)壓下降，噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性率89％，表明尿失禁動(dòng)物模型建立成功。 5．Hoech

10、st33258標(biāo)記的MDC注射治療：MDC制取并標(biāo)記后，注射到細(xì)胞來源大鼠的尿道，并設(shè)立對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射后1天，細(xì)胞保持小圓形，局限于注射部位，14天左右熒光細(xì)胞呈長梭形，分布擴(kuò)大，提示移植細(xì)胞在尿道內(nèi)發(fā)生了有限的遷移，14后，部分熒光細(xì)胞逐漸變?nèi)?，一部分?xì)胞失去正常的形態(tài)，提示移植細(xì)胞部分分化和融合，局部種植。 6．恥骨上置管尿動(dòng)力學(xué)檢查：腹壓漏尿點(diǎn)壓(ALPP)在注射組、假注射組、對(duì)照組注射后一周三組分別為：20.48

11、±1.08cmH2O、16.30±0.40cmH2O、24.46±0.35cmH2O(F=33.35，P<0.01)，注射后兩周三組分別為：22.36±0.64cmH2O、18.44±0.80cmH2O、25.44±0.58cmH2O(F=59.58，P<0.01)，三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDC注射后能顯著提高大鼠的ALPP，噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性率顯著下降，注射MDC組效果優(yōu)于注射無血清培養(yǎng)基DM

12、EM組，但與未注射組相比，注射MDC的尿失禁大鼠的控尿能力并不能完全恢復(fù)到正常。 結(jié)論： 1．采用差速貼壁技術(shù)和酶消化法可以成功分離、純化培養(yǎng)MDC。 2．α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白可以對(duì)骨骼肌MDC和肌管進(jìn)行鑒定。 3．燒灼尿道中段括約肌的方法可以成功建立大鼠尿失禁動(dòng)物模型。 4．熒光燃料Hoechst33258可以標(biāo)記MDC。 5．大鼠尿道括約肌損傷后近期MDC注射，可修復(fù)替代損傷的括約肌細(xì)胞