1、第一章高糖通過ERK1/2細胞信號通路介導抑制STAT3表達對大鼠骨髓來源MAPC細胞TGF-β1及VEGF表達調(diào)控
　　目的：通過檢測高糖對骨髓來源MAPC細胞TGF-β1和VEGF表達水半的影響,探討高糖干預MAPC細胞TGF-β1和VEGF表達的機制。
　　方法：從鼠骨髓來源的細胞中分離、純化得到MAPC細胞。MAPC細胞依照一定的種植密度孵育在普通細胞培養(yǎng)基(含有5.5mM葡萄糖)和高糖培養(yǎng)基中(含有25.5mM葡萄

2、糖)中,最長孵育時間14天。MAPC細胞孵育在含有左旋葡萄糖(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的高滲培養(yǎng)基中作為高滲對照,以排除高滲透壓對細胞的影響。實驗中利用Q-RT-PCR、ELISA以及免疫熒光顯微成像分析在不同的時間點和條件培基中MAPC細胞TGF-β1 mRNA以及蛋白質(zhì)表達水平。同時,利用Q-RT-PCR分析VEGF表達水平。通過Western blot分析高糖及普通培養(yǎng)條件下MAPC細胞ERK1/2以及STAT3激活

3、表達水平的差異。通過共聚焦顯微鏡了解不同培養(yǎng)條件下,STAT3核轉(zhuǎn)移的能力。
　　結(jié)果：在普通低糖培養(yǎng)基中孵育的MAPC細胞,其TGF-β1和VEGF的表達均能檢測到。在高糖培基中孵育36h后TGF-β1 mRNA表達明顯升高,為對照組的20-fold,同時其蛋白表達水平也是對照組的5倍多。而與此相反,VEGF表達水平,不論是mRNA表達還是蛋白質(zhì)表達均在高糖刺激下明顯下調(diào)。在高糖培基中孵育的MAPC細胞,其ERK1/2磷酸化水平

4、明顯上調(diào),與此同時,STAT3在Tyr705殘基而不是Ser727殘基,磷酸化水平明顯上調(diào)。通過ERK1/2上游MEK特效抑制劑PD98059以及U0126的抑制作用,ERK1/2磷酸化水平受到顯著抑制,同時TGF-β1表達水平也受到抑制,而磷酸化STAT(Tyr705)水平得到恢復,VEGF表達也得到恢復而升高。利用AG490特效性阻斷JAK2達到特效阻斷磷酸化STAT3(Tyr705)的目的,VEGF表達下調(diào),而TGF-β1表達上調(diào)

5、,MAPC細胞ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有受到影響。以此說明STAT3在調(diào)控機制中的關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論：高糖可以通過ERK1/2信號途徑調(diào)抑制STAT(Tyr705)磷酸化水平,從而上調(diào)MAPC細胞TGF-β1表達,抑制VEGF表達。實驗數(shù)據(jù)證明,對ERK1/2與STAT3信號通路的調(diào)控是維系MAPC細胞TGF-β1和VEGF表達平衡的關(guān)鍵。
　　第二章高糖通過TGF-β1誘導Smad和非Smad雙信號通路阻滯MAPC細胞G

6、1/S期進程
　　目的：研究高糖對骨髓來源MAPC細胞周期轉(zhuǎn)換的影響,及其可能的機制。
　　方法：分離純化鼠骨髓細胞來源的MAPC細胞。該細胞孵育在普通培養(yǎng)基(含有5.5mM葡萄糖)以及高糖培養(yǎng)基(25.5mM葡萄糖)中,最長孵育14天。孵育在左旋葡萄糖培基中(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的MAPC細胞作為高滲透壓培養(yǎng)的對照組,用于排除高滲對實驗結(jié)果的干預。通過FACS(流式細胞儀)檢測不同培養(yǎng)條件下MAPC細胞的

7、周期變化。Western blot和免疫熒光被用于分析P21 Waf1/Cip1和P27Kip1的表達水。Smad磷酸化水平通過Western blot分析。應(yīng)用ELISA和Q-RT-PCR反映TGF-β1在MAPC細胞中的表達。
　　結(jié)果：FACS結(jié)果顯示,MAPC細胞的G1期延長,而S期縮短,G,期沒有顯著改變。Western blot以及免疫熒光顯微成像結(jié)果都表明,細胞周期調(diào)控蛋白P21Waf1/Cip1的表達水平在高糖刺激

8、下升高,而P27Kip1的表達水平卻沒有改變。ELISA結(jié)果顯示TGF-β1表達升高,利用TGF-β1抗體可以有效阻斷TGF-β1表達。高糖在促進TGF-β1表達的同時,TGF-β2型受體的表達也隨之增加。但TGF-β2型受體的表達會隨時間而達到飽和。利用Western blot分析Smad2/3激活水平以及磷酸化CDK2表達水平。當TGF-β1抗體中和了TGF-β1,以及PD98059抑制了ERK1/2的磷酸化時,高糖介導的P21 W

9、af1/Cip1表達增加,CDK2激活水平的提高,以及最終的MAPC細胞周期轉(zhuǎn)換的阻滯,都將受到阻止而向相反的趨勢發(fā)展。與此同時,ERK1/2磷酸化水平的變化可以發(fā)揮調(diào)控Sinad信號途徑的作用。
　　結(jié)論：高糖可以在G1/S期阻斷早期分化階段MAPC細胞的周期轉(zhuǎn)換,其機制是通過TGF-β1介導ERK1/2信號激活,從而調(diào)控Smad和非Smad信號途徑影響細胞周期調(diào)控抑制蛋白P21Waf1/Cip1的表達水平。
　　第三章高

10、糖干預MAPC細胞分化趨勢的探討
　　目的：探討高糖對鼠骨髓來源MAPC細胞向內(nèi)皮細胞或是平滑肌細胞分化趨勢的影響
　　方法：復蘇凍存的MAPC細胞,作為實驗細胞來源。將MAPC細胞孵育在不同的條件培養(yǎng)基中:普通低糖培養(yǎng)基含有5.5mM葡萄糖;高糖培養(yǎng)基含有25.5mM葡萄糖;高滲培養(yǎng)基含有20mM左旋匍萄糖和5.5mM葡萄糖。MAPC細胞孵育在以上條件培養(yǎng)基中最多達14天。利用Q-RT-PCR分析特異性內(nèi)皮標記物vWF、C

11、D31以及F1k1的表達水平,同時也分析平滑肌標記物α-SMA和SM22-αmRNA水平。Western blot被用于分析以上三種內(nèi)皮標記物以及平滑肌標記物的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：在高糖的刺激下,Q-RT-PCR分析結(jié)果顯示,vWF、CD31以及F1k1三種內(nèi)皮特異性標記物mRNA表達水平降低。與此相反,通過TGF-β1抗體預處理MAPC細胞,阻斷其分泌后,vWF、CD31和F1k1 mRNA表達水平明顯上調(diào),與單純高糖刺激

12、存在明顯差異。同時Western blot分析顯示,高糖可以使以上三種內(nèi)皮標記物表達高峰值延遲。在高糖條件下,α-SMA和SM22-α作為特異性平滑肌細胞標記物,其表達趨勢與內(nèi)皮特意性標記明顯不同。Α-SMA和SM22-α mRNA表達受到高糖刺激而升高;因高糖刺激而分泌增加的TGF-β1被TGF-β1抗體中和后,其表達水平受到顯著抑制。
　　結(jié)論：高糖可以提升平滑肌標記物表達水平,同時抑制內(nèi)皮細胞標記物表達水平。以上現(xiàn)象表明,高