1、血栓形成導(dǎo)致的心、腦血管血栓性疾病已成為全球性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，所引起的死亡約占人類(lèi)非意外死亡原因的40％～50％。近年來(lái)，針對(duì)血栓形成的危險(xiǎn)因素，如血小板粘附、聚集性增高，血液凝固性增強(qiáng)，纖溶活性減弱以及血液粘度增高方面的基礎(chǔ)和臨床研究有了很大進(jìn)展。然而，血栓形成是一個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，強(qiáng)烈依賴(lài)局部血流和血管壁狀況。尤其動(dòng)脈血栓的發(fā)生，絕大多數(shù)是在血管壁病變的基礎(chǔ)上，動(dòng)脈狹窄或痙攣，異常的血流激活血小板，導(dǎo)致以血小板始動(dòng)的血栓形成。參與血栓

2、形成的血小板—白細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞受體—配體網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)和粘附機(jī)制也日益成為抗血栓藥理及新藥研究的靶點(diǎn)。本項(xiàng)研究采用宏觀血液流變學(xué)、細(xì)胞血液流變學(xué)和分子血液流變學(xué)研究方法逐層深入，旨在探討剪應(yīng)力誘導(dǎo)下血漿和全血粘度改變對(duì)血栓形成的影響，血小板、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞與血栓形成的關(guān)系，從細(xì)胞和分子水平揭示血栓形成過(guò)程中各要素隨剪應(yīng)力大小和作用時(shí)間長(zhǎng)短而改變的規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，觀察活血化瘀中藥有效成分川芎嗪和丹參酚酸B對(duì)剪切誘導(dǎo)血栓形成的聯(lián)合干預(yù)

3、作用，尋求最佳組合劑量、優(yōu)勢(shì)作用靶點(diǎn)以及可能存在的協(xié)同效應(yīng)。以期為血栓形成的基礎(chǔ)研究提供切實(shí)可行的思路與方法，也為臨床血栓性疾病的防治和抗血栓藥物的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 上篇剪切誘導(dǎo)血栓形成規(guī)律和機(jī)制研究富血小板血漿(PRP)實(shí)驗(yàn)：從血小板微血栓形成，剪切后血小板隨時(shí)間繼發(fā)聚集率變化，剪應(yīng)力與聚集率相關(guān)性，剪應(yīng)力與血漿粘度改變的關(guān)系，聚集率與血漿粘度的相關(guān)性方面揭示剪應(yīng)力誘導(dǎo)血小板聚集、血漿粘度變化的規(guī)律。應(yīng)用錐—板控應(yīng)力流變儀、

4、熒光倒置顯微鏡、血小板聚集儀，采用比濁法和顯微鏡計(jì)數(shù)法，記錄血小板聚集和血漿粘度變化，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)體外自發(fā)性血小板聚集發(fā)生；血小板血栓隨高剪應(yīng)力作用后時(shí)間延長(zhǎng)而增大；血小板受到15Pa和20Pa剪應(yīng)力作用后4小時(shí)內(nèi)，發(fā)生了明顯的繼發(fā)聚集，與剪切時(shí)間和剪應(yīng)力呈正相關(guān)；血小板受到15Pa和20Pa剪應(yīng)力作用后15分鐘內(nèi)，用圖像分析軟件計(jì)算像素來(lái)表示聚集面積所得結(jié)果有非常顯著差異，

5、此結(jié)果和顯微鏡下計(jì)數(shù)方法計(jì)算15分鐘末的聚集率顯著相關(guān)，剪應(yīng)力和聚集率呈正相關(guān)；高剪應(yīng)力(15Pa以上)作用可以明顯升高PRP血漿粘度，低剪應(yīng)力(1.8Pa)升高血漿粘度的作用不明顯，剪應(yīng)力大小和血漿粘度變化之間沒(méi)有明顯相關(guān)性；PRP血漿粘度改變和血小板聚集率中度相關(guān)。結(jié)論：剪應(yīng)力通過(guò)誘導(dǎo)血小板聚集、血漿粘度升高而引發(fā)微血栓形成，剪切PRP實(shí)驗(yàn)中血小板聚集率增大是血漿粘度升高的主要原因。用15分鐘連續(xù)記錄，以面積評(píng)估血小板聚集程度，可以

6、應(yīng)用于SIPA的測(cè)定。 全血實(shí)驗(yàn)：進(jìn)一步探討剪切誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集，血漿粘度升高，微血栓形成病理過(guò)程發(fā)生的細(xì)胞、分子機(jī)制，和剪切強(qiáng)度(包括剪應(yīng)力和剪切時(shí)間的組合)相關(guān)性；明確血小板、白細(xì)胞自身活化以及相互間粘附聚集在血栓形成中的作用。運(yùn)用雙因素3×3水平析因設(shè)計(jì)設(shè)立剪切強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用錐—板控應(yīng)力流變儀、熒光倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)；采用全血法流式細(xì)胞術(shù)、顯微鏡計(jì)數(shù)法和紫外分光光度法；SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟

7、件進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析和相關(guān)分析，STATISTICA統(tǒng)計(jì)軟件多因素方差MANOVA分析協(xié)同作用，三維曲面擬合方法得出二元二次曲面描述因素間非線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果首先明確了最高剪切強(qiáng)度20Pa250s約使千分之一的紅細(xì)胞發(fā)生溶血，不足以影響剪切誘導(dǎo)全血血小板聚集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；鏡下觀察到隨剪應(yīng)力升高而增大的血小板血栓；剪切誘導(dǎo)全血血小板聚集和剪應(yīng)力水平、剪切時(shí)間相關(guān)，但兩者的協(xié)同作用不明顯；剪應(yīng)力大小與血液粘度(升高—降低—升高)變化轉(zhuǎn)折

8、時(shí)間點(diǎn)呈顯著負(fù)相關(guān)，高剪應(yīng)力時(shí)粘度上升率和剪應(yīng)力大小呈正相關(guān)，以此建立一種可以定量剪應(yīng)力誘導(dǎo)全血粘度變化的指標(biāo)；剪應(yīng)力誘導(dǎo)血小板活化、血小板白細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察四個(gè)剪切強(qiáng)度5Pa5s、5Pa250s、20Pa5s和20Pa250s。5Pa5s條件下，血小板GPⅠb/Ⅴ/Ⅸ和白細(xì)胞CD11b已有表達(dá)。剪切強(qiáng)度達(dá)到5Pa250s時(shí)，血小板聚集明顯增強(qiáng)，PLA形成、PMPs釋放和血小板P-Selectin表達(dá)也明顯增多。血小板GPⅡb/Ⅲa表達(dá)

9、在剪應(yīng)力增大、剪切時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度才很顯著。 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：探討剪應(yīng)力作用后微血管內(nèi)皮細(xì)胞PS異位發(fā)生、粘附分子表達(dá)的規(guī)律，以及對(duì)內(nèi)皮損傷進(jìn)而血栓形成的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)、熒光相差倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、HAAKERS600控應(yīng)力流變儀板—板和錐—板剪切裝置、免疫熒光染色法和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)和設(shè)備；SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析。成功培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞，熒光免疫組織化學(xué)鑒定合格

10、；用生理范圍的剪應(yīng)力1.5Pa和高剪應(yīng)力3Pa作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞都有PS異位；1.5Pa組的PS異位率8.38％小于靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的異位率；高剪應(yīng)力3Pa作用組PS異位率為24.23％，顯著高于1.5Pa組，而且，與1.5Pa組相比，3Pa組的Annexin-V-FITC+/PI+比率顯著增大；與3Pa450s相比，3Pa900s組有大量PI+細(xì)胞；與低剪應(yīng)力1.5Pa相比，高剪應(yīng)力3Pa作用后微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)顯著地增強(qiáng)，

11、未得出微血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)的結(jié)果。結(jié)論：高剪應(yīng)力誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞PS異位發(fā)生，3PaPS異位率為24.23％，3Pa剪應(yīng)力引起明顯細(xì)胞膜破損，已經(jīng)造成了內(nèi)皮損傷，隨時(shí)間延長(zhǎng)損傷更嚴(yán)重。高剪應(yīng)力誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，無(wú)VCAM-1表達(dá)。 由此可見(jiàn)，剪應(yīng)力通過(guò)對(duì)血小板、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白、粘附分子的表達(dá)、細(xì)胞間粘附聚集及宏觀血液流變性等多種因素的影響而誘導(dǎo)血栓形成。本研究表明，在血栓形成與剪切強(qiáng)度

12、之間有顯著相關(guān)性。 下篇川芎嗪與丹參酚酸B對(duì)剪切誘導(dǎo)血栓形成聯(lián)合干預(yù)作用的機(jī)理研究探討了川芎嗪和丹酚酸B分別與聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于血小板、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞以及宏觀血液流變性的影響，以及兩者聯(lián)合應(yīng)用抑制剪切誘導(dǎo)的血栓形成的有效比例與協(xié)同效應(yīng)。采用雙因素3×3水平析因設(shè)計(jì)，川芎嗪和丹參酚酸B為雙因素，各選三個(gè)濃度(0，小劑量，大劑量)為三水平；SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析及析因方差分析，STATISTICA統(tǒng)

13、計(jì)軟件多因素方差MANOVA分析協(xié)同作用，三維曲面擬合方法得出二元二次曲面描述因素間非線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果顯示：(1)丹參酚酸B和川芎嗪可以改善血漿粘度，有降低全血血液粘度上升率的趨勢(shì)，還可降低PRP血小板聚集率以及全血血小板聚集率，最佳劑量組合是丹參酚酸B20μM和川芎嗪0.37mM。此組合可以通過(guò)抗血小板膜糖蛋白分子表達(dá)、抗白細(xì)胞粘附分子表達(dá)、減少PMPs釋放來(lái)發(fā)揮抑制血小板聚集，血小板和白細(xì)胞粘附，進(jìn)而抗血栓形成的作用。川芎嗪0.73m

14、M的高劑量對(duì)血漿粘度有不良反應(yīng)的趨勢(shì)。丹參酚酸B對(duì)血小板聚集顯示出突出的抑制作用，但PRP實(shí)驗(yàn)中高劑量顯著而全血實(shí)驗(yàn)中低劑量作用更強(qiáng)。(2)川芎嗪和丹參酚酸B可以改善諸多因素引起的內(nèi)皮損傷、粘附分子表達(dá)，川芎嗪對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用更有優(yōu)勢(shì)，川芎嗪高劑量(0.73mM)聯(lián)用低劑量的丹參酚酸B(10μM)有非常顯著的協(xié)同作用。 總結(jié)綜上所述，本研究結(jié)合血液流變學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)分析方法，揭示血漿和血液粘度，細(xì)胞