1、背景：
　　Th17細(xì)胞在非嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘(NEA)的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其通過分泌一系列細(xì)胞因子介導(dǎo)了具有激素抵抗特征的中性粒細(xì)胞性氣道炎癥。血紅素加氧酶(HO)-1是血紅素代謝途徑的限速酶，在各種Th細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中發(fā)揮廣泛的抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能，但其在NEA中的作用尚不清楚。課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)能抑制EA小鼠模型中Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥，表明HO-1對(duì)哮喘氣道炎癥具有拮抗作用。本研

2、究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究HO-1在NEA模型中對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的作用及機(jī)制。
　　目的：
　　通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Th17/Treg細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子在NEA哮喘模型中的作用，并在此基礎(chǔ)上千預(yù)HO-1表達(dá)以闡明HO-1能否調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡及其機(jī)制，為臨床認(rèn)識(shí)與防治重度/難治性哮喘提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、利用DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠建立NEA模型，經(jīng)鼻吸入O

3、VA誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)腹腔注射hemin或SnPP干預(yù)HO-1表達(dá)。通過Western blot檢測肺組織HO-1表達(dá)，BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和觀察肺組織病理改變，以評(píng)估HO-1對(duì)NEA模型中性粒細(xì)胞性氣道炎癥的作用。
　　2、FCM檢測小鼠縱隔淋巴結(jié)(MLN)和脾臟中Th17/Treg細(xì)胞比例，Westernblot檢測肺組織RORγt/Foxp3表達(dá)水平，ELISA檢測BALF中IL-17A/IL-10含量，以觀察

4、HO-1調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡的作用;同時(shí)FCM檢測MLN和脾臟中Th1/Th2比例，Real-time PCR檢測肺組織T-bet/GATA-3 mRNA表達(dá)，ELISA檢測BALF中IFN-γ/IL-4含量，以觀察NEA模型中Th1/Th2細(xì)胞變化及HO-1對(duì)其的影響。
　　3、在已建立的NEA模型基礎(chǔ)上，經(jīng)尾靜脈注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染HO-1 siRNA和腹腔注射hemin干預(yù)HO-1表達(dá)，通過觀察肺組織病理改變，Wester

5、n blot檢測肺組織HO-1和RORγt表達(dá)水平，以證實(shí)HO-1 siRNA可逆轉(zhuǎn)hemin拮抗氣道炎癥和抑制Th17細(xì)胞反應(yīng)的作用。
　　4、分離小鼠脾臟na(i)ve T細(xì)胞并在Th17或Treg細(xì)胞培養(yǎng)條件下體外誘導(dǎo)分化，在此基礎(chǔ)上加入一定濃度的hemin或SnPP干預(yù)HO-1表達(dá)，通過FCM檢測Th17/Treg細(xì)胞比例，Real-time PCR檢測RORγt和IL-17A/IL-10 mRNA表達(dá)，ELISA檢測上清

6、液中IL-17A含量，以觀察HO-1體外對(duì)na(i)ve T細(xì)胞向Th17/Treg細(xì)胞分化的影響。
　　5、小鼠腹腔注射hemin或SnPP干預(yù)細(xì)胞中HO-1表達(dá)，分離CD4+T細(xì)胞并加入IL-6/IL-2刺激1小時(shí)體外誘導(dǎo)STAT3/STAT5磷酸化，Western blot檢測p-STAT3/p-STAT5及STAT3/STAT5表達(dá)水平，以進(jìn)一步闡明HO-1調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　

7、　1、OVA激發(fā)DO11.10小鼠能產(chǎn)生Th17細(xì)胞介導(dǎo)的以PMN浸潤為主的抗原特異性氣道炎癥，給予HO-1誘導(dǎo)劑hemin上調(diào)HO-1表達(dá)后，可顯著抑制氣道炎癥并降低BALF中細(xì)胞總數(shù)和PMN數(shù)量。
　　2、Hemin誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)明顯降低NEA小鼠模型中脾臟和MLN Th17細(xì)胞亞群比例，下調(diào)肺組織RORγt表達(dá)并減少BALF中IL-17A含量，同時(shí)顯著增加Treg細(xì)胞比例和IL-10水平，從而抑制Th17免疫反應(yīng)，。

8、r>　　3、體內(nèi)HO-1 siRNA干預(yù)可逆轉(zhuǎn)hemin的抗炎效應(yīng)，同時(shí)HO-1對(duì)Th17細(xì)胞的抑制作用也減弱。
　　4、Hemin誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可通過抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化下調(diào)RORγt表達(dá)，抑制na(i)ve T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化并促進(jìn)其向Treg細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡。
　　結(jié)論：
　　1、HO-1可抑制OVA誘導(dǎo)的NEA氣道炎癥模型中Th17免疫反應(yīng)，同時(shí)上調(diào)Treg細(xì)胞，