1、隨著重組DNA技術(shù)的飛速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了多種生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，其中以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器，尤其是轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺生物反應(yīng)器和轉(zhuǎn)基因家禽的輸卵管生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)最為突出，能在不損傷機(jī)體正常生理功能的條件下源源不斷地獲得表達(dá)產(chǎn)品。家禽具有繁殖周期短、生產(chǎn)性能高、研究成本較低等優(yōu)點(diǎn)，其輸卵管是生產(chǎn)蛋白質(zhì)的天然“發(fā)酵罐”，更加適合作為生產(chǎn)重組蛋白的生物反應(yīng)器。但由于家禽特殊的生殖生理特點(diǎn)，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)一直落后于其它動(dòng)物。雖然近幾年來相

2、關(guān)技術(shù)有所突破，但家禽轉(zhuǎn)基因研究仍有許多理論和技術(shù)難題有待突破，距離產(chǎn)業(yè)化開發(fā)仍有很遠(yuǎn)的路要走。為此，尋求禽類的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突破和開辟新的研究方法已成為當(dāng)前研究工作的重點(diǎn)。 本課題組用自行克隆的雞卵清蛋白(OV)基因表達(dá)調(diào)控序列構(gòu)建成雞輸卵管定位表達(dá)載體，以人溶菌酶和組織激肽釋放酶(hK1)基因?yàn)槟康幕虻碾u輸卵管暫態(tài)表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果表明，通過翅靜脈注射一定劑量的重組載體后，能表達(dá)一定水平的重組酶并分泌到試驗(yàn)雞的蛋清中，具有一定的開

3、發(fā)利用價(jià)值。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以hK1基因?yàn)槟康幕?，通過對(duì)先前構(gòu)建的雞輸卵管特異表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化改造，旨在獲得結(jié)構(gòu)更為合理、表達(dá)水平更高、維持時(shí)間更長的表達(dá)載體。在先前構(gòu)建的pOV3K載體的基礎(chǔ)上，分別通過酶切消化或PCR擴(kuò)增等方法，將其中3.0kb的OV基因5'-調(diào)控序列的長度分步縮減，獲得三個(gè)新的重組載體分別命名為pOV4K、pOV5K和pOV6K。將此重組載體與25kDa聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PE

4、I)混合，經(jīng)翅靜脈注射產(chǎn)蛋雞，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測蛋清中的重組酶活性，結(jié)果表明，含1.1kbOV基因5'-調(diào)控序列的pOV6K表達(dá)水平和表達(dá)時(shí)間均不如含3.0kbOV基因5'-調(diào)控序列的pOV3K，含2.1kbOV基因5'-調(diào)控序列的pOV4K和含1.7kbOV基因5'-調(diào)控序列的pOV5K與含3.0kbOV基因5'-調(diào)控序列的pOV3K表達(dá)水平相當(dāng)，說明1.7kbOV基因5'-調(diào)控序列足以指導(dǎo)外源基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平

5、，將由pOV5K中的1.7kbOV基因5'-調(diào)控序列、hK1cDNA及牛生長激素基因終止信號(hào)(BGHpA)組成的表達(dá)盒，插入到含禽腺聯(lián)病毒(AAAV)ITR和Rep蛋白基因的載體中，旨在獲得穩(wěn)定表達(dá)載體，獲得新的重組表達(dá)載體命名為pITRLRepOV5K。用上述方法將PEI包被的重組載體注射產(chǎn)蛋雞，蛋清中的重組酶活性檢測結(jié)果表明，在注射相同拷貝數(shù)重組載體的條件下，重組載體pITRLRepOV5K的表達(dá)量及維持時(shí)間均優(yōu)于pOV5K，不僅獲

6、得了結(jié)構(gòu)更為合理、表達(dá)水平更高、維持時(shí)間更長的雞輸卵管特異表達(dá)載體，而且為以AAAV為基因轉(zhuǎn)移載體制備轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器打下了基礎(chǔ)。 鑒于以pITRLRepOV5K載體建立的雞輸卵管暫態(tài)表達(dá)技術(shù)的潛在應(yīng)用價(jià)值，有必要對(duì)其進(jìn)一步研究。將2mgpITRLRepOV5K載體與PEI混合后注射產(chǎn)蛋雞，對(duì)注射蛋雞組織進(jìn)行重組酶活性檢測，結(jié)果顯示外源基因表達(dá)僅限于雞的輸卵管組織，提示重組載體表達(dá)具有較好的組織特異性；在初次載體注射后檢