1、背景:
　　乙型肝炎病毒引起的慢性乙型肝炎是一種重大的傳染性疾病。乙型肝炎主要流行于中國及其它一些亞洲國家，目前約有十分之一的中國人口是乙型肝炎病毒攜帶者。慢性乙型肝炎可以導(dǎo)致肝硬化及肝癌的發(fā)生，并且目前沒有藥物可以完全根治，治療種類少且療效有限。因此，尋找一種有效的治療乙型肝炎的方法迫在眉睫。
　　RNA干擾(RNA interfering)是指一些小的雙鏈RNA(dsRNA)可高效、特異的促使mRNA降解，阻斷相應(yīng)基因表

2、達(dá)。應(yīng)用RNAi治療乙型肝炎是一種有效的治療策略，能夠突破普通藥物治療療效的局限性，克服易產(chǎn)生逃逸突變株使病情更加惡化等缺點。但化學(xué)合成的siRNA成本高、不穩(wěn)定、體內(nèi)傳輸困難，進(jìn)入細(xì)胞后易被降解，因此，需要研發(fā)一種新的傳輸方式，病毒載體為我們提供了一個契機(jī)。
　　腺相關(guān)病毒AAV(Adeno associated virus)屬于人類細(xì)小病毒科(parvoviridae)。自建立第一個AAV的感染性克隆以來，重組AAV載體被廣泛

3、應(yīng)用到基因治療研究及臨床前/臨床實驗中，嘗試治療多種疾病。AAV具有無致病性、低免疫原性、能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂的細(xì)胞、可介導(dǎo)外源基因長期表達(dá)等優(yōu)點。因此，本課題選擇腺相關(guān)病毒作為短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)傳遞的載體，進(jìn)行抗乙型肝炎病毒的研究。
　　乙型肝炎病毒宿主范圍窄，且沒有適合的動物模型進(jìn)行抗病毒藥物的評估，嚴(yán)重制約了抗乙型肝炎病毒藥物的研發(fā)。因此研發(fā)一種新型的乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型對研究慢性乙型肝炎的致病機(jī)制及新型

4、抗病毒藥物的篩查和評估具有重要意義。
　　目的:
　　1、構(gòu)建乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型。
　　2、構(gòu)建一系列AAV2-shRNA表達(dá)載體，體外驗證各AAV2-shRNA的抗病毒效果。
　　3、在乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型上評估AAV2-shRNA的抗病毒效果。
　　方法:
　　1、將可復(fù)制性的1.2拷貝的HBV克隆到去除rep和cap基因的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒表達(dá)載體pSSV9（rep-/cap-

5、）中，構(gòu)建出質(zhì)粒表達(dá)載體pSSV9-1.2HBV，并利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)制備成重組病毒(AAV8-1.2HBV)。將AAV8-1.2HBV尾靜脈注射C57BL/6小鼠，定期采血、取組織樣本通過qPCR、RT-qPCR、ELISA、免疫組織化學(xué)染色、Masson染色等方法檢測血清中HBV DNA變化、肝組織中HBV cDNA變化、血清中抗原分泌情況、肝細(xì)胞內(nèi)抗原表達(dá)情況、病理變化及模型小鼠肝組織纖維化指標(biāo)的變化等。
　　2、制備一系

6、列shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSC-H1-shRNA和串聯(lián)形式的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSC-H1-shRNAmultiple，利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)包裝成AAV2-shRNA重組病毒。用AAV2-shRNA重組病毒感染HepG2.2.15細(xì)胞系，定期收獲培養(yǎng)上清液和培養(yǎng)細(xì)胞，通過qPCR、RT-qPCR和ELISA等方法從DNA水平，RNA水平和蛋白水平評估各AAV2-shRNA抗病毒效果。
　　3、將體外篩選出的抗病毒效果顯著的AA

7、V2-shRNA病毒尾靜脈注射乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型，定期采血、取組織樣本通過測量與方法1中相同的各項指標(biāo)，評估AAV2-shRNA體內(nèi)抗HBV的效果。
　　結(jié)果:
　　1、模型小鼠血清中可持續(xù)檢測到高滴度的HBV DNA(107 copy/mL)超過6個月;模型小鼠血清和肝細(xì)胞中分別可檢測到HBsAg、 HBeAg的分泌與HBsAg、HBcAg的表達(dá)。病理切片及纖維化指標(biāo)定量檢測顯示，小鼠肝組織沒有明顯的急性炎癥反

8、應(yīng)，但是能誘導(dǎo)肝組織脂肪變性和纖維化。
　　2、所有的AAV2-shRNA體外均有抑制HBV的能力，抗病毒效果呈劑量依賴關(guān)系，但是感染劑量超過MOI=104時，抗HBV效果未有顯著增加。相同感染劑量下，AAV2-shRNA1+3對HBV的抑制率要顯著大于AAV2-shRNA1和AAV2-shRNA1+3+4。
　　3、體內(nèi)驗證AAV2-shRNA1，AAV2-shRNA1+3抗HBV效果，各項結(jié)果顯示AAV2-shRNA1+

9、3具有更強(qiáng)的抗病毒能力，與體外結(jié)果相符。檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)顯示，AAV2-shRNA1+3進(jìn)行抗HBV治療可以改善肝組織脂肪變性和肝組織纖維化的程度。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型，此模型不產(chǎn)生明顯的急性炎癥反應(yīng)，但是能誘導(dǎo)小鼠肝組織纖維化，為慢性乙型肝炎和肝硬化治療藥物的篩選和評估提供了一個良好的平臺。
　　2、體外篩選出的AAV2-shRNA1+3，具有顯著的抗HBV復(fù)制的作用。