1、RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)在細(xì)胞內(nèi)與RNA結(jié)合,使RNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。它們與mRNA前體、mRNA、非編碼RNA相互作用,對(duì)RNA的生物合成、選擇性剪接、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞定位等過(guò)程產(chǎn)生影響,在基因的轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平起到重要的調(diào)控作用。RBP功能涉及到各個(gè)生理和病理過(guò)程,已經(jīng)報(bào)道部分RBP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；實(shí)驗(yàn)室前期工作以人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)PTB(Polypyrim

2、idine-Tract Binding protein)、PCBP2(Poly(rc)Binding Protein2)等RBPs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。
　　 為了研究抗腫瘤藥對(duì)RBP表達(dá)的影響,我們選取了全反式維甲酸(All-TransRetinoic Acid,ATRA)和雷帕霉素(rapamycin)兩種藥物。ATRA作用于靶基因啟動(dòng)子區(qū)的維甲酸應(yīng)答元件(Retinoic Acid Responding Element,R

3、ARE)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化；而雷帕霉素作用于mTOR(mammalianTarget Of Rapamycin)通路影響基因表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡,產(chǎn)生抗腫瘤作用。
　　 本研究將全反式維甲酸、雷帕霉素以不同的濃度和時(shí)間作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(T98G細(xì)胞),首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光和TUNEL(TdT-mediated dUTPnick end labeling脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)

4、的缺口末端標(biāo)記)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到活細(xì)胞數(shù)量減少、分化或凋亡的細(xì)胞數(shù)量增多,驗(yàn)證了兩種藥物對(duì)T98G細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),并為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)摸索到了合適的實(shí)驗(yàn)條件和科學(xué)的處理方法；進(jìn)而通過(guò)Western Blot檢測(cè)了四種RBP即UNR(Upstream of N—Ras)、UNRIP(UNR-Interacting Protein)、PCBP2和PTB的表達(dá)變化,其中UNR、UNRIP、PCBP2的表達(dá)隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)或藥物濃度的增加逐漸下調(diào),提

5、示UNR、UNRIP、PCBP2可能為抗腫瘤藥物作用通路的下游靶蛋白。
　　 為了通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證RBP和藥物作用后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)系,因此對(duì)UNR、UNRIP、PCBP2的真核表達(dá)載體進(jìn)行鑒定及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定；另外,為了研究全反式維甲酸、雷帕霉素是否通過(guò)翻譯水平機(jī)制使RBP下調(diào),對(duì)UNR,UNRIP的5’端非編碼區(qū)(Untranslated Region,UTR)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(Internal

6、Ribosome Entry Sites,IRES)進(jìn)行克隆并將其連接到雙順?lè)醋訜晒廨d體。雙順?lè)醋虞d體上帶有海腎(Renilla)、螢火蟲(chóng)(Firefly)兩種熒光編碼基因,但只有海腎熒光編碼基因前有啟動(dòng)子區(qū)及5’UTR的編碼序列,因此將其表達(dá)后僅顯示海腎熒光。實(shí)驗(yàn)中將RBP的5’UTR IRES連接到兩種熒光編碼基因之間后,因IRES具有類似tRNA的三葉草結(jié)構(gòu),可以直接與核糖體結(jié)合、起始螢火蟲(chóng)熒光編碼基因翻譯。雙順?lè)醋訜晒廨d體的構(gòu)建

7、為進(jìn)一步研究全反式維甲酸和雷帕霉素是否通過(guò)IRES對(duì)RBP產(chǎn)生調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,全反式維甲酸、雷帕霉素作用于T98G細(xì)胞,可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化或誘導(dǎo)凋亡；UNR、UNRIP、PCBP2隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)或藥物濃度的增加表達(dá)逐漸下調(diào)。UNR、UNRIP、PCBP2的真核表達(dá)載體和5’UTR IRES雙順?lè)醋訜晒廨d體可用于進(jìn)一步驗(yàn)證RBP和藥物作用后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)系及其分子機(jī)制。上述