1、哺乳動物DNA甲基化主要指CpG島的甲基化修飾，是一種重要的表觀遺傳模式，與基因激活、基因印記、細胞分化與發(fā)育、以及衰老和癌變等一系列生命過程密切相關，是當今分子生物學領域研究熱點。雖然CpG島甲基化的分析方法發(fā)展較為迅速，但因目前缺乏有效的高通量甲基化分析方法，以致嚴重阻礙了這些生命活動調控規(guī)律的研究?；蛐酒墙畮啄陙戆l(fā)展極快的一項技術平臺，具有高通量、高靈敏度、快速自動等顯著的特點，目前已應用于基因表達譜分析、新基因發(fā)現、基因突

2、變及多態(tài)性分析等多項分子研究領域，CpG島甲基化檢測芯片也有所發(fā)展，但速度緩慢。針對這一需要，本論文發(fā)展了三種類型甲基化檢測芯片，為實現更高通量甲基化分析芯片的制備，還對CpG島數據庫的構建做了大膽探索。具體內容如下： (1)IGFBP7基因甲基化譜寡核苷酸芯片分析技術研究IGFBP7是一種胰島素樣生長因子結合蛋白編碼基因，這種蛋白能夠通過與IGF-2結合來調節(jié)細胞生長和抑制有絲分裂活性，對于卵泡發(fā)育及胚胎的生長發(fā)育都具有重要的

3、調控作用，而且也是一種重要的腫瘤抑制基因。本研究的目的旨在開發(fā)一種用于IGFBP7基因甲基化譜分析的寡核苷酸芯片。該方法的步驟為：提取正常人血液乖人類乳腺癌組織樣本基因組DNA，進行亞硫酸氫鹽修飾，修飾過后的基因組DNA中甲基化的胞嘧啶保持不變，而未發(fā)生甲基化的胞嘧啶則轉變?yōu)槟蜞奏?，以修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，擴增引物為測序引物，也就是將引物設計在不含有CpG二核苷酸的位點上，結果導致所擴增區(qū)域未甲基化胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶，而

4、甲基化的位則不發(fā)生變化。其中以正常人血液基因組DNA為陰性對照樣本，而M.sssI處理的(這種酶的處理可以導致所有基因組中CpG二核苷酸中的胞嘧啶都發(fā)生甲基化)正常人血液基因組DNA為陽性對照。對于腫瘤樣本，由于各個片斷甲基化的狀態(tài)不同，擴增的PCR產物就可能是各種甲基化狀態(tài)的一種混合物。本研究針對PCR產物中18個CpG位點設計了6對寡核苷酸探針，每對探針包含2-4個CpG二核苷酸位點，其中一條探針與甲基化的靶序列的相匹配，另一條探針

5、與未甲基化的靶序列相匹配。將探針固定在處理后的DAKO玻片上，然后與CY3標記后的PCR產物雜交，激光掃描儀掃描并分析雜交結果。采用陽性克隆PCR產物與陰性克隆PCR產物參比建立定量檢測曲線。參比實驗發(fā)現，對于每對探針，PCR產物甲基化水平與熒光信號強度比值M/(M+U)有良好的線性相關性。本研究共檢測了15對乳腺癌組織IGFBP7基因甲基化譜，發(fā)現所有樣本中的所有位點甲基化程度都在85％以上，這種雜交結果采用亞硫酸氫鹽測序法得到進一步

6、證明。本實驗的結果表明此芯片技術可以作為一種有用的工具進行IGFBP7基因多個CpG位點的甲基化譜定量分析。 (2)基于微陣列與雙色熒光雜交的高通量分析甲基化檢測芯片研究目前所報導的用于甲基化檢測的芯片都是針對一個樣本的多個基因或多個位點進行高通量分析，包括前一個實驗也是如此，這些方法都不能同時分析大量樣本以利于有效篩選生物標記物。因此建立一種高通量分析大量樣本的基因芯片方法具有重要意義。在本研究中發(fā)展了一種新的方法，具體操作為

7、：首先提取人類乳腺腫瘤樣本基因組DNA，并準備陰性和陽性樣本(方法同上)，將基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理，以亞硫酸氫鹽處理的DNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物固定在多聚賴氨酸處理的玻片上，做成PCR產物芯片。設計一對包含三個相鄰的CpG位點探針，一條探針是針對發(fā)生甲基化的靶序列，采用CY5(紅色)標記，另一條是針對未甲基化的靶序列，采用CY3(綠色)標記，用雙色熒光標記的探針與芯片雜交，雜交信號通過掃描儀不同濾光片掃描后分別獲取

8、CY5或CY3信號強度，信號采用GenepixPro3.0軟件處理，通過綠色信號強度與紅色信號強度的對比來確定樣本甲基化的含量。陰性和陽性PCR產物參比實驗發(fā)現，樣本甲基化含量與CY5/(CY5+CY3)的比值呈良好的線性相關(R2=0.9871)，將該技術應用于檢測20例乳腺癌組織、6例相對應的正常乳腺組織和一株肝癌細胞系共27個樣本的IGFBP7基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現除血液組織樣本是陰性外，其他都呈陽性，此結果與前一個實驗的結果相一

9、致，并得到進一步測序證明。此項研究結果表明該方法能夠用于大規(guī)模樣本甲基化定量分析，對于篩選甲基化分子標記基因具有廣闊的應用前景。 (3)基于尼龍膜雜交和地高辛標記的一種高通量甲基化基因芯片研究前一個研究獲得的方法雖能夠高通量定量分析大量樣本甲基化狀態(tài)，具有廣闊的應用前景，但其檢測靈敏度不高，為了提高檢測靈敏度和適用范圍，本研究又發(fā)展了亞硫酸氫鹽修飾靶序列DNA芯片方法。與第二種方法不同之處在于將雜交載體由玻片變?yōu)槟猃埬?，因為尼?/p>

10、膜固定DNA量較大而且固定效率較高；第二個不同之處，在于將探針標記物由熒光標記改為地高辛標記。地高辛是近年來發(fā)展起來的一種高靈敏度的檢測方法，可以取代同位標記用于Southernblot和Northernblot檢測；第三個不同之處在于本研究還將本研究首先亞硫氫鹽轉化的基因組DNA直接固定在尼龍膜上制作基因組DNA芯片。首先將樣本基因組DNA亞硫酸氫鹽轉化并進行PCR擴增，擴增出來的PCR產物固定在尼龍膜上進行甲基化分析。為了獲得該方法

11、的靈敏度，將陽性PCR產物片段與陰性PCR產物片段按不同比例混合成甲基化含量不同的樣本固定制作成芯片，另外還將陽性基因組DNA和陰性基因組DNA按不同比例混合成甲基化含量不同的樣本。同時還將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA在帶有陽離子的尼龍膜上，制作亞硫酸氫鹽修飾靶序列DNA陣列。然后與標有地高辛的探針雜交，采用化學發(fā)光的方法來檢測雜交信號。結果發(fā)現，固定的乳腺癌腫瘤樣本與正常人血液組織樣本檢測結果與前二種方法檢測的一致，并得到進一步的克隆

12、測序證明。直接參比陰性和陽性PCR產物可以發(fā)現該雜交體系每個點可以檢測到3.05×105拷貝數片段，而參比陰性和陽性基因組DNA結果發(fā)現，可以從40960個正常甲基化DNA中檢測到一個非正常DNA樣本；將1μg基因組DNA固定于尼龍膜上，選取合適的探針和雜交溫度，可以區(qū)分甲基化的等位基因，由此證明這兩種方法是可靠靈敏的，具有大規(guī)模檢測等位基因甲基化程度較低的樣本而且具有從大量樣本中高通量篩選甲基化分子標記物的應用潛力。 (4)基

13、于抑制性差減雜交技術構建CpG島文庫的方法學研究構建CpG島文庫是發(fā)展某些高通量DNA甲基化分析芯片的基礎與前提，目前構建CpG島文庫的方法較為煩瑣而且篩選也較為困難，本研究將抑制性差減雜交技術和甲基化特殊檢測原理相結合，旨在發(fā)展一種簡便的構建CpG島文庫的方法。此方法將正常人血液基因組DNA酶切后的片段的接上接頭，然后作甲基化敏感酶HPAⅡ酶切，再進行Linker-PCR，其產物作為Driver；M.SssⅠ酶處理的人類基因組DNA酶

14、切后作為Tester，接上接頭之后Tester做一步HAaⅡ酶切。經過兩次雜交后，然后將雜交產物進行兩次抑制性PCR，并將PCR產物克隆入載體，挑取克隆分別進行PCR和測序檢測差減雜交效果，結果發(fā)現在挑取的288個克隆中，PCR擴增有121個克隆插入的片段大于100bp，選取12個PCR擴增出來的克隆進行測序，共有7個克隆得到理想的測序結果，差減效率為58.3％，在這些測序片段中，有三條序列GC含量較高，而且CpG位點較多；其他四條序列